Gaetano Odierna » 10.Citoscheletro: microtubuli e filamenti intermedi

Microtubuli

I microtubuli sono strutture citoplasmatiche cave, di 25 nm di diametro, presenti in tutte le cellule eucariotiche.

Caratteristiche strutturali dei microtubuli

I microtubuli sono elementi cavi orientati con una estremità positiva e l’altra negativa. Sono polimeri di un eterodimero, l’ α- e β-tubulina. Il diametro esterno è di 25 nm, quello interno di 15 nm. In sezioni trasversali si osservano 13 sub-unità. Pertanto i microtubuli sono costituiti da 13 protofilamenti affiancati.

In figura: Micrograzia elettronica di un microtubulo ottenuta per colorazione negativa (A), sua sezione trasversale (B) e loro rappresentazione schematica (C) e (D).

Microtubuli – Assemblaggio in vitro

Le sub-unità di α- e β-tubulina si trovano sempre associate a formare un eterodimero di tubulina. Entrambe le sub-unità legano una molecola di GTP, ma solo quella della β-tubulina è idrolizzabile a GDP. In vitro la polimerizzazione degli eterodimeri avviene a 37°C, in presenza di GTP, di Mg⁺⁺, di EGTA (una sostanza che sequestra il Ca⁺⁺) e di proteine collettivamente denominate MAPs (Microtubule-Associated Proteins). Gli eterodimeri polimerizzano a tandem ordinati a formare i protofilamenti lineari orientati. Iniziano con la sub-unità α (estremità negativa) e terminano con la sub-unità β (estremità positiva). Tredici protofilamenti si associano lateralmente a registro per poi chiudersi a formare il microtubulo. L’aggiunta di nuovi eterodimeri avviene preferenzialmente all’estremità positiva, dove costituiscono il cappuccio a GTP. Tuttavia poco dopo la GTP idrolizza a GDP.

Microtubuli – Cinetica dell’assemblaggio in vitro

La cinetica dello assemblaggio dei microtubuli è bifasica. Prevede una fase lenta di nucleazione dei dimeri a formare corti oligomeri. Segue la fase veloce di allungamento dei microtubuli per aggiunta preferenziale dei dimeri all’estremità + fino a raggiungere lo “steady point”; le velocità di aggiunta all’estremità + e di perdita dei monomeri dalla estremità – si eguagliano. Ovvero si raggiunge una concentrazione critica di dimeri che limita la crescita dei microtubuli.

In figura: Schema (semplificato) della cinetica dell’assemblaggio in vitro di un microtubulo. L’aggiunta dei microtubuli avviene anche all’estremità negativa ma a velocità nettamente inferiore rispetto a quella dell’estremità positiva.

Microtubuli – Instabilità dinamica dei microtubuli

La concentrazione costante dei dimeri di αβ-tubulina, diversamente dai microfilamenti di actina, non è raggiunta tramite il “tread milling”, ma secondo una modalità denominata “instabilità dinamica”. Secondo tale modello una volta raggiunto il valore critico la concentrazione dei dimeri di αβ-tubulina resta costante perché si instaura il bilancio netto tra la quantità di dimeri aggiunti ai microtubuli in crescita e quelli liberati dai microtubuli in accorciamento. Ovvero allo “steady point” l’allungamento di un microtubulo comporta necessariamente l’accorciamento di un altro.

In figura: Microtubuli all’equilibrio. La concentrazione dei dimeri è costante, così come la lunghezza dei microtubuli in toto. Varia il numero dei microtubuli presenti e la loro lunghezza.

Microtubuli – Modello del cappuccio per l’instabilità dinamica

La crescita di un microtubulo è strettamente legata alla presenza alla estremità positiva del cappuccio a GTP, che come visto in precedenza poco dopo è idrolizzata a GDP. Se la concentrazione dei dimeri liberi è alta, la velocità di aggiunta è maggiore dell’idrolisi del GTP a GDP e il microtubulo cresce. Quando la concentrazione dei dimeri è al disotto di un livello critico la velocità di aggiunta dei dimeri è inferiore a quella dell’idrolisi e il microtubulo espone il cappuccio a GDP. Ciò rende instabile il microtubulo, che collassa, diminuendo velocemente di lunghezza fino anche a scomparire del tutto.

Microtubuli – Assemblaggio in vivo

In vivo i microtubuli si assemblano a partire da specifiche regioni del citoplasma denominate MTOC (Centri che Organizzano i MicroTubuli). Da tale regione i microtubuli si irradiano nel citoplasma formando una rete dinamica di filamenti microtubulari che presentano l’estremità negativa infissa nel MTOC. Al microscopio elettronico gli MTOC appaiono come aggregati di materiale amorfo elettrondenso.

In figura 1: Fibroblasti in coltura esposti per un breve periodo alla colchicina (un veleno microtubulare che provoca la depolimerizza i microtubuli) e successivamente trattati con anticorpi antitubulina. Si osserva che i nuovi microtubuli si assemblano a partire dagli MTOC.

Microtubuli – Dinamica dei microtubuli

Cellule del lievito Schizosaccharomyces pombe, esprimenti una proteina che lega i microtubuli  fusa con la GFP (la proteina verde fluorescente), filmate dopo shock da freddo (provoca la depolimerizzazione del microtubuli). Nel filmato è ripresa la formazione della rete microtubulare subito dopo l’anafase mitotica e la dinamica dei microtubuli interfasici. In mitosi si osserva la continua nucleazione dei microtubuli dall’MTOC equatoriale . In interfase si nota la dinamicità dei microtubuli e la loro nucleazione da siti indi pendenti di MTOC

Microtubuli – Assemblaggio in vivo – Ruolo della γ-tubulina

Oltre alle isoforme α e β della tubulina, è stata rinvenuta una ulteriore isoforma, la γ-tubulina. Tale molecola è localizzata esclusivamente negli MTOCs.

Le reazioni di immunolocalizazione con oro-colloidale mostrano che le molecole di γ-tubulina sono strettamente associate a formare un anello in stretta connessione con i microtubuli in allungamento. Pertanto, le γ-tubuline svolgono un ruolo importante nel processo di nucleazione dei dimeri di α- e β- tubulina.

In figura: In figura: A sinistra, micrografia elettronica di una regione di un MTCO in cui le γ-tubuline sono state evidenziate con anticorpi antitubulina marcati con oro colloidale. A destra, schema rappresentante il ruolo delle γ-tubuline quale centro di nucleazione nella formazione dei microtubuli.

Microtubuli – Traffico vescicolare

I microtubuli formano piste dinamiche per il traffico direzionato di vescicole o organelli. Tali elementi sono legati a proteine motrici, che li trasportano lungo i microtubuli, in direzione positiva o negativa.

Le proteine motrici appartengono appartengono a due famiglie:

• le dineine citoplasmatiche (mediano il trasporto di vescicole o organelli verso l’estremità negativa);
• le chinesine ((mediano il trasporto di vescicole o organelli verso l’estremità positiva).

Centrosoma e centrioli

Il centrosoma è il più importante MTOC cellulare. Rappresenta il centro cellulare, da cui, in mitosi, derivano i microtubuli del fuso mitotico. Nel centrosoma delle cellule animali è presente una struttura costituita da microtubuli stabili, denominata diplosoma in quanto costituita da due centrioli disposti ortogonalmente tra loro.

Centrioli – Struttura

I centrioli sono lunghi 1-2 μm e spessi 0,25 μm. Sono costituiti da 9 triplette di microtubuli stabili disposti in periferia a delimitare un lume. In ciascuna tripletta i microtubuli sono indicati con le lettere A (quello più interno), B (quello intermedio) e C (quello esterno). Il microtubulo A è completo, presentando la parete con 13 protofilamenti, I microtubuli B e C sono incompleti, ma si completano addossandosi, rispettivamente al microtubulo A e B.

Il ruolo dei centrioli non è ben definito. Si suppone che siano importanti nel concentrare il materiale del centrosoma e per la formazione dei microtubuli.

I centrioli costituiscono il corpuscolo basale delle ciglia e dei flagelli.

Ciglia, flagelli e motilità microtubulare

I microtubuli sono alla base di due importanti sistemi di motilità cellulare: le ciglia e flagelli. Sono sottili espansioni della membrana plasmatica. Sono presenti in tutti gli organismi animali. Costituiscono il mezzo di locomozione di due importanti classi di protozoi, a cui devono il nome: i Ciliati e i Flagellati.

Ciglia nei metazoi

Negli organismi pluricellulari le ciglia sono particolarmente abbondanti nella porzione apicale di alcune cellule epiteliali.

Ciglia e flagelli – Struttura

Le ciglia e i flagelli sono strutturalmente simili; differiscono soprattutto per le dimensioni. I flagelli sono molto più lunghi delle ciglia.

La parte che emerge dal citoplasma è detto assonema, mentre la parte infissa nel citoplasma è detta corpuscolo basale o blefaroblasto.

Ciglia e flagelli – Struttura del blefaroblasto

Il corpuscolo basale o blefaroblasto è omologabile ad un centriolo. Presenta, infatti, nove triplette di microtubuli. I microtuboli C non emergono nell’assonema, ma prendono contatto con proteine della membrana plasmatica tramite fibre di transizione.

Notare la placca basale tra il blefaroblasto e l’assonema.

In figura: Sezione longitudinale di un ciglio e sue sezioni trasverse livello del corpuscolo basale e dell’assonema.

Ciglia e flagelli – Struttura dell’assonema

Nell’assonema, perifericamente, sono presenti 9 coppie di microtubuli (A e B), legate tra loro da ponti di nexina.

Dalla placca basale, che è un MTOC, emerge la coppia centrale dei microtubuli. La coppia centrale è connessa ai microtubuli periferici da fibre radiali.

I microtubuli A delle 9 coppie esterne presentano due braccia di una proteina motrice la Dineina assonemale, che è alla base del movimento ciliare e flagellare.

Motilità ciliare

Il battito ciliare dipende dalle braccia di dineina, le quali si attaccano al microtubolo B della coppia adiacente, idrolizzano ATP. Se non infissi nel citoplasma, si avrebbe lo scorrimento reciproco delle coppie. Essendo bloccati nel citoplasma il movimento di scorrimento si traduce in piegamento laterale, ovvero in battito ciliare. Cessato l’impulso il ciglio ritorna passivamente alla posizione iniziale.

Coordinamento del battito ciliare

Nelle cellule epiteliali le ciglia sono presenti in gran numero ed allineate in file parallele. Per essere efficace è necessario che il movimento delle ciglia presenti lungo una fila e quelle presenti nelle file precedenti e successive sia coordinato. Si genera un tipo di movimento detto metacronale. A coordinare tale movimento sarebbero le radichette ciliari, ovvero i prolungamenti proteici che dai blefaroblasti ciliari si addentrano convergendo in una regione del citooplasma.

Filamenti intermedi: generalità

I filamenti intermedi sono una componente abbondante del citoscheletro delle cellule animali. La loro presenza nella cellule vegetali è dubbia.

Si distinguono dai microfilamenti sottili e dai microtubuli:

• per il loro spessore che è di 8-12 nm e pertanto intermedio tra quello dei microfilamenti di actina (6 nm) e dei microtubuli (25 nm);
• per costituire una popolazione eterogenea di filamenti, ciascuna specifica per un tipo cellulare.

In figura: Cellula ovarica di una capra himalaiana in coltura, colorata con anticorpi anti-vimentina (in blu) e anti-actina (in rosso). Il nucleo è colorato in verde

Filamenti intermedi: assemblaggio

Le unità monomeriche dei filamenti intermedi presentano domini comuni. L’assemblaggio dei filamenti intermedi avviene tramite formazione di dimeri, i quali si associano lateralmente a formare i tetrameri. Da questi si formano i lunghi cordoni solidi, altamente resistenti alla trazione, secondo modalità non completamente accertate. Nell’immagine sono riportate due ipotetici schemi dell’assemblaggio dei filamenti intermedi.

In figura: Stuttura delle unità monomeriche dei filamenti intermedi e due ipotetici schemi del loro assemblaggio. Il modello a sinistra prevede l’associazione laterale dei tetrameri a costituire i filamenti di lunghezza unitaria (ULFs) che si assemblano a tandem a formare i lunghi cordoni soldi. A destra i tetrameri si associano lateralmente e a tandem a costituire piani che poi si ripegano in strutture cave.

Filamenti intermedi: le lamine nucleari

Le lamine nucleari presentano caratteristiche peculiari rispetto agli altri filamenti intermedi:

• non formano cordoni solidi, ma si assemblano a formare una solida rete, che riveste la membrana interna dei nuclei;
• sono presenti in tutte le cellule eucariotiche.

Dinamicità dei filamenti intermedi

Per molto tempo si è ritenuto che i filamenti intermedi (IFs) fossero elementi citoscheletrici stabili, rigidi ed indeformabili, non soggetti a processi di assemblaggio/frammentazione.

Tale veduta sta ora cambiando alla luce di recenti esperimenti. Tali studi, basati su subunità di IFS-GFP, microiniettate o espresse da cellule transfettate, hanno mostrato che le subunità venivano continuamente incorporate nei filamenti intermedi preesistenti.

Diversamente dai filamenti sottili di actina e dai microtubuli, nei filamenti intermedi l’incorporazione delle subunità può avvenire in qualsiasi regione.

Si ritiene che l’incorporazione delle nuove subunità sia necessaria per il regolare mantenimento della rete di filamenti intermedi.

Il filmato evidenzia la dinamicità dei filamenti intermedi. Viene mostrato il comportamento di cellule embrionali di topo della linea NIH3T3 che esprimono la vimentina-GFP.

Proteine associate con i filamenti intermedi

Tali proteine hanno la funzione:

• Di supportare la rete di filamenti intermedi (IFs).
• Di connettere i filamenti intermedi ad altre strutture. Tra queste degne di nota sono:
  • la plectina: connette gli IFs ai microtubuli;
  • il recettore della Lamina B ancora la lamina fibrosa alla membrana nucleare;
  • l’Ankyrina: lega gli IFs ai microfilamenti;
  • la desmoplacchina: lega gli IFs ai desmsomi e emidesmosomi.

In figura: Micrografia al microscopio elettronico psedocolorata del citoplasma in seguito a “deep – freeze hetching”. La plectina è immunolocalizzata da anticorpi marcati con oro.