Gaetano Odierna » 15.Perossisomi, Mitocondri

Perossisomi – morfologia

I perossisomi sono organelli di forma solitamente sferica dal diametro di 0,5 -0,7 μm. Sono circondati da una singola membrana e si trovano nel citoplasma di tutte le cellule eucariotiche in un numero che varia da uno (nei lieviti) a centinaia, ad esempio nelle cellule renali o epatiche dei mammiferi.
I perossisomi furono scoperti nel 1954 da J. Rhodin, uno studente svedese che per primo li descrisse nel suo elaborato di tesi.
Nel 1966 DeDuve mediante centrifugazione differenziata riuscì ad isolare e a caratterizzare biochimicamente i peressisomi, osservando che contengono una varietà di enzimi ossidativi (perossidasi) che producono H₂O₂ (perossido di idrogeno, da cui deriva il nome di tali organelli).

In figura A: Immagine al microscopio confocale di una cellula endoteliale bovina in cui i perossisomi sono evidenziati in verde, i mitocondri in rosso e il nucleo in azzurro (immagine tratta da Invitrogen).
In figura (B e C) Immagine al Microscopio elettronico di perosisomi di un mollusco marino con e senza inclusioni cristalline (immagine tratta da Peroxisomes).

Perossisomi – morfologia (segue)

Il perossido di idrogeno prodotto è un potente ossidante, velenoso per la cellula, che viene immediatamente convertito in acqua e ossigeno negli stessi organelli grazie all’enzima catalasi.

Gli enzimi solubili presenti nei perossisomi variano da cellula a cellula, ma in tutti casi è sempre presente la catalasi, che, pertanto, ne è l’enzima marcatore.

In figura A: Immagine al microscopio confocale di una cellula endoteliale bovina in cui i perossisomi sono evidenziati in verde, i mitocondri in rosso e il nucleo in azzurro (immagine tratta da Invitrogen).
In figura (B e C) Immagine al Microscopio elettronico di perosisomi di un mollusco marino con e senza inclusioni cristalline (immagine tratta da Peroxisomes ).

Perossisomi – metabolismo del H₂O₂

Le funzioni metaboliche dei perossisomi variano secondo la specie, il tipo cellulare, lo stadio di sviluppo e le condizioni ambientali. In tutti i casi, la maggior parte delle attività metaboliche conduce alla formazione di H₂O₂da parte delle perossidasi, secondo la reazione indicata in figura 1.

L’ H₂O₂ prodotto è ridotto nei perossisomi stessi ad opera della catalasi secondo la modalità catalasica o perossidasica, come indicato in figura 2.

In figura 3:  Monostrato di fibroblasti di pollo – i perossisomi sono marcati in verde, i filamenti di actina in blu e nuclei in rosso. Immagine da Molecular Expressions

Perossisomi – funzioni

Le principali funzioni dei perossisomi sono:

• Detossificazione: nei perossisomi vengono degradate sostanze nocive introdotte negli organismi, quali: alcol etilico, alcol metilico, fenoli, nitriti, xenobionti.
• Rimozione dei radicali liberi e ROS: in collaborazione con enzimi citoplasmatici i perossisomi provvedono a rimuovere i radicali liberi e le forme reattive dell’Ossigeno (ROS) che si formano durante le normali attività metaboliche della cellula.

In figura: schema di un perossisoma. Immagine da Molecular Expressions

Perossisomi – funzioni (segue)

• Ossidazione degli acidi grassi: in tutti gli eucarioti, eccetto i mammiferi, i perossisomi costituiscono il solo sito in cui avviene l’ossidazione degli acidi grassi. Nei mammiferi, nei perossisomi inizia la degradazione degli acidi grassi a catena lunga(C_16-24) o ramificati fino alla produzione di acidi grassi a catena corta (C₁₂) o lineari, che vengono degradati a acetilcoenzima A nei mitocondri).
• Ossidazione dell’acido urico: l’acido urico è prodotto nella degradazione delle purine degli acidi nucleici. Nelle specie che possiedono l’enzima urato-ossidasi, l’acido urico è trasformato in allantoina, che a sua volta è degradata ed espulsa. I primati, non possedendo l’urato-ossidasi, espellono l’acido urico tal quale nelle urine.

In figura: schema di un perossisoma. Immagine da Molecular Expressions

Perossisomi – biogenesi

Per lungo tempo i perossisomi, al pari dei mitocondri e cloroplasti, sono stati considerati organelli semiautonomi, i quali si accrescono per poi scindersi.
A partire dal 2005 si sono accumulate evidenze che hanno chiaramente dimostrato che le vescicole perossisomali derivano da una regione specializzata del Reticolo endoplasmatic0, il reticolo perossisomale dove è anche sintetizzata una proteina integrale di membrana, la Pex3p (le proteine di membrana dei perossisomi vengono indicate con la sigla Pex – La Pex3p è la sola perossina ad essere sintentizzata nel RE, le altre Pex e gli enzimi perossisomiali contenuti nella matrice, sono sintetizzati nel citoplasma e indirizzate ai perossisomi). Dal reticolo perossisomale si staccano lamelle che poi fondono tra loro o con preesistenti perossisomi (il distacco delle lamelle è mediata dalla Pex19p che si lega alla Pex3, mentre la fusione è mediata tramite le Pex1p e Pex6p. Le altre perossine vengono incorporate nelle membrana e fungono da recettori/traslocatori per gli enzimi solubili della matrice).
In figura: schematizzazione della biogenesi dei perossisomi. Immagine modificata da: Peroxisome Biogenesis

Perossisomi – importo degli enzimi perossisomali

Gli enzimi solubili dei perossisomi sono sintetizzati nel citoplasma. Presentano specifici segnali per l’importo ai perossisomi (PTS1 o PTS2). Gli enzimi che presentano il segnale PTS1, come ad esempio la catalasi, sono riconosciuti da una particolare perossina–spola, la Pex5p (step 1 e 2 dell’immagine a fianco). Il complessso catalasi-Pex5p sono riconosciuti dal recettore/troslacatore presente sulla membrana dei perossisomi (step3). La catalasi è traslocata all’interno dei perossisomi (step4 dell’immagine) mentre la pex5 è riciclata e può iniziare un nuovo ciclo (step5 dell’immagine).
Gli enzimi che presentano il segnale PST2 vengono riconosciuti e traslocati ai perossisomi da un’altra proteina spola la Pex7p.

In figura: schema dell’importo della catalasi nella matrice perossisomale. Immagine da Life science

Mitocondri – numero e forma

I mitocondri sono presenti in tutte le cellule eucariotiche, ad eccezione dei globuli rossi dei mammiferi.
Costituiscono la maggiore fonte dell’energia intracellulare.
Furono descritti per primo da Altmann nel 1884.
Nel 1899, Michaelis utilizzando il colorante sopravitale verde Janus dimostrò che nei mitocondri avvengono reazioni di ossidazioni (il verde Janus penetra nelle cellule vive dove nel citoplasma viene ridotto in un derivato incolore (leucoderivato), penetrato nei mitocondri viene riossidato, riacquistando così il colore primitivo).

Hanno forma ovoidale di 1 – 6 μm x 0,2-1 μm

Il numero dei mitocondri/cellula varia da 1.000 a 2.000, fino a 30.000 negli ovociti.

In figura: mitocondri di cellule di glioblastomi umani evidenziati in immunofluorescenza con specifici anticorpi fluoriscinati (ab3298).Immagine da abcam

Mitocondri – localizzazione cellulare

Nelle cellule i mitocondri si concentrano maggiormente nelle zone a più elevata attività metabolica, ovvero dove è richiesto una maggiore quantità di energia
In figura: negli spermatozoi i mitocondri sono disposti a spirale nella porzione centrale della coda (immagine da Med Library). Nella fibra muscolare striata cardiaca i mitocondri sono disposti parallelamente alle miofibrille  Immagine da University of West Indies)

Mitocondri – locomozione cellulare

I mitocondri sono organelli dinamici, dotati di rapidi movimenti. Si muovono lungo piste microtubulari.

In figura: relazioni tra mitocrondri e microtubuli evedenziata in immunoflurescenza in A (micrubuli in verde, mitocondri in rosso, nuclei in azzurro (immagine da Microscopyu e schematizzata lungo l’assone di una cellula nervosa in B (immagine da Nature).

Mitocondri – ultrastruttura

I mitocondri sono rivestiti da una doppia membrana:

• la membrana mitocondriale esterna;
• la membrana mitocondriale interna, che presenta numerose invaginazioni (creste mitocondriali) nello spazio da essa racchiuso, che è denominato matrice mitocondriale o mitoblasto.

Lo spazio tra le due membrane costituisce lo spazio intermembrana.
In figura: immagini al microscopio elettronico a trasmissione (immagine da University of Miami e a scansione (immagine da Cellular Organelles ) di un mitocondrio.

Mitocondri – varietà ultrastrutturali delle creste

La morfologia delle invaginazioni della membrana interna è variabile tra i tipi cellulari. In base alla loro morfologia i mitocondri vengono classificati come segue:

• mitocondri di tipo  classico (sono le più comuni con le invaginazioni simili a creste);
• mitocondri di tipo tubulare (sono tipici delle cellule steroidogenetiche; le invaginazioni sono simili a tubuli);
• mitocondri di tipo prismatico (sono tipici degli astrociti; le invaginazioni hanno forma triangolare);
• mitocondri di forma intermedia (presentano invaginazioni sia a forma di creste sia di tubuli).

Da notare che la diversità delle creste è esclusivamente morfologica; non riflette alcuna diversità funzionale.
In figura: micrografie elettroniche rappresentative della diversità morfologica delle invaginazioni della membrana interna. Immagine da: Pacific Union College
Visionare anche le immagini nel sito Johannes Gutenberg.

Differenze mofologiche tra mitocondri a riposo e attivi

Nei mitocondri a riposo la maggior parte dello spazio è occupato dalla matrice mitocondriale (rappresenta la forma convenzionale o ortodossa); nello stato di attività metabolica lo spazio della matrice si riduce sensibilmente mentre aumenta notevolmente lo spazio intermembrana (rappresenta la forma condensata).

In figura: immagini di mitocondri a riposo (in alto) e
in attiva respirazione (in basso). Immagine da University of Tennessee

Mitocondri – composizione: isolamento delle frazioni sub-mitocondriali

Per lo studio dei costituenti dei quattro compartimenti dei mitocondri (membrana esterna e interna, contenuto dello spazio intermembra e della matrice) sono stati messi a punti diverse tecniche, tutte basate sulla differente sensibilità della membrana esterna e di quella interna a trattamenti quali ad esempio l’esposizione a blandi detergenti o a soluzioni ipotoniche. Successive serie di centrifugazioni consentono l’isolamento e l’analisi dei componenti dei quatto compartimenti.
Nella figura a lato è schematizzata una metodica che sfrutta la diversa sensibilità alle soluzioni ipotoniche della membrana esterna, che si frammenta, rispetto a quella interna, che rimane integra.
In figura: schema di isolamento delle frazioni sub-mitocondriali. Immagine modificata da: Plantphys

Mitocondri – Composizione membrana esterna

La membrana esterna ha composizione in lipidi del 50% e presenta colesterolo; pertanto è simile a quella del RE.

Presenta numerosi enzimi, quali ad esempio quelli dell’allungamento della catena degli acidi grassi. Caratterista delle membrana esterna è la presenza di porine: proteine transmembrana che formano canali non selettivi, che consentono il passaggio di molecole fino a 5.000 Dalton.
In figura 1: rapperesentazione schematica di un mitocondrio. Immagine da Thinkquest.

In figura 2: schema della membrana esterna e di quella citoplasmatica di un batterio. Il riquadro evidenzia una porina. Immagine da IDECOM.

Mitocondri – Composizione dello spazio intermembrana

Lo spazio intermembrana contiene enzimi che utilizzano l’ATP per fosforilare i nucleotidi difosfati in nucleotidi trifosfati.
In figura: rapperesentazione schematica di un mitocondrio. Immagine da Thinkquest 2

Mitocondri – Composizione della membrana interna e delle creste

La membrana interna ha un alto contenuto in proteine (circa il 70%).Ha similitudini con la membrana dei batteri: è priva di colesterolo, presenta cardiolipidi.

Sono presenti i complessi della fosforilazione ossidativa che comprende:

• i Complessi della catena di trasporto degli elettroni:
  • complesso I (NADH-CoQ reduttasi);
  • compesso II (Succinato-CoQ reduttasi);
  • complesso III (CoQH₂-citocromo c reduttasi);
  • complesso IV ( citocromo c ossidasi).

Mitocondri – Composizione della membrana interna e delle creste (segue)

• Il complesso della ATP sintentasi, costituito dalla particella F_o ( canale protonico trans-membrana) a cui è accoppiato la particella F₁ (dotato di attività ATP sintetasi).

Nella membrana interna sono anche presenti enzimi che in collaborazione con gli enzimi del Reticolo endoplasmatico Liscio, operano la sintesi degli ormoni steroidei.

In figura in alto: rapperesentazione schematica di un mitocondrio. Immagine da Thinkquest 2

In figura in basso: disposizione dei complessi della fosforilazione ossidativa. Immagine da Nature 2

Mitocondri –membrana interna visualizzazione delle particelle F₀-F₁

I complessi transmembrana F₀F₁ possono essere messi in evidenza in microscopia elettronica sottoponendo la matrice mitocondriale a shock ipotonico e successiva colorazione negativa: si osserva che le particelle F₀F₁sporgono in fuori nella matrice, restano attaccate alla membrana interna mediante un peduncolo (la partecella F₀); le particelle F₁ appaiono come delle sfere attaccate alle particelle F₀.
In figura: micrografia elettronica di creste mitocondriali colorate negativamente dopo schock osmotico (Imagine da The American Society for Cell Biology) e, a destra, riscostruzione schematica del complesso F₀F₁ prima e dopo lo shock osmotico (Immagine da CNR)

Mitocondri – composizione della matrice

La matrice mitocondriale ha una consistenza gelatinosa a causa della elevata concentrazione di proteine e di altre molecole idrosolubili. Sono presenti:

• gli enzimi del ciclo di Krebs:
  • enzimi per l’ossidazione degli acidi grassi (nei mammiferi);
  • enzimi per l’ossidazione del piruvato.

• molecole DNA:
  • mRNA, rRNA, tRNA;
  • Ribosomi mitocondriali (con caratteristiche più simili;
    ai ribosomi batterici che a quelli citoplasmatici);
  • DNA e RNA polimerasi;
  • NAD⁺ e FAD e loro forme ridotte (NADH e FADH₂);
  • ioni calcio e magnesio.

In figura: rapperesentazione schematica di un mitocondrio. Immagine da Thinkquest 2

Mitocondri – DNA mitocondriale

Nella matrice mitocondriale sono presenti un numero variabile, in genere da 5 a 10, di molecole di DNA (mtDNA) per mitocondrio.

L’mtDNA è circolare e non associato a proteine. E’, pertanto, simile al DNA dei batteri.
Negli animali l’mtDNA contiene da 16.000 a 19.000 coppie di basi.
In figura: immagine al microscopio elettronico del DNA mitocondriale
di cellula epatica di ratto. Immagine da:University of Texas Medical Branch.

Mitocondri – coordinamento della sintesi proteica mitocondriale e nucleare

L’mtDNA codifica per un numero esiguo di proteine della membrana interna (nell’uomo, ad esempio 13).

La maggior parte delle proteine mitocondriale sono sintetizzate nel citoplasma e poi importate ai mitocondri. Ciò comporta l’esistenza di un sistema o di sistemi che coordinano la sintesi proteica mitocondriale e nucleare.

In figura: rappresentazione schematica delle proteine mitocondriali sintetizzate dal mtDNA (in rosso) e dal DNA nucleare (in verde). Immagine da Molecular Biology of the Cell.

Mitocondri – importo delle proteine mitocondriali

Le proteine mitocondriali sintetizzate nel citoplasma presentano specifici segnali che le indirizzano allo spazio intermembrana,oppure alla membrana interna o alla matrice.
L’importo prevede l’esistenza di specifici recettori/traslocatori presenti sulla membrana esterna (TOM) e sulla membrana interna (TIM).

In figura: importo di proteine destinate alla matrice mitocondriale. Immagine da: University of Western Australia

Mitocondri – fissione e fusione

In seguito alla mitosi i mitocondri vengono ripartiti nelle due cellule figlie. Il numero dei mitocondri è successivamente ripristinato in seguito a crescita e fissione.

I mitocondri possono fondersi tra loro a formare una rete mitocondriale.

In figura: micrografie elettroniche e schema di un mitocondrio in fissione. Immagine da

General aspects of mitochondrial biogenesis.

Mitocondri – origine evolutiva dei mitocondri

La teoria più accreditata sull’origine evolutiva dei mitocondri è quella nota come “ipotesi endosimbionte“, che è basata sulle somiglianze dei mitocondri con le cellule batteriche.
L’ipotesi prevede che i mitocondri deriverebbero da una simbiosi di un batterio aerobio con una primitiva cellula eucariotica anaerobia. Parte del genoma batterico sarebbe stato successivamente trasferito nel genoma nucleare.
In figura: schema dell’ipotesi endosimbionte dell’origine dei mitocondri.
Immagine da Università degli Studi Roma 3.

Mitocondri – funzioni

Molte delle attività cellulari richiedono una apporto di energia che è fornita dall’idrolisi dell’ATP ad ADP. Una delle principali funzioni dei mitocondri è di effettuare le trasformazioni energetiche che conducono alla produzione di ATP (ADP ⇒ ATP).

In figura in alto: schema di alcune delle attività cellulari che richiedono energia che è fornita dall’idrolisi dell’ATP in ADP. Nei mitocondri avviene la sintesi dell’ATP a partire ADP+Pinorganico.
In figura in basso: ciclo dell’ATP- L’idrolisi dell’ATP produce energia, mentre la sua sintesi richiede energia.

Immagini da Cell Unit.

Mitocondri – funzioni (segue)

L’energia necessaria alla produzione di ATP è ottenuta dalla demolizione di molecole introdotte con gli alimenti, principalmente dal glucosio.
La demolizione del glucosio avviene in quattro tappe:

1. glicolisi (avviene nel citoplasma) – demolizione del glucosio (C₆) in due molecole di piruvato (C₃) – Produzione di due molecole di ATP;
2.formazione dell’acetil coenzima A (avviene nella matrice): traslocazione del piruvato (C₃) nella matrice e sua ossidazione in acetato (C₂) e coniugazione con il Coenzima A a formare l’acetil-CoA.

Mitocondri – funzioni (segue)

3. Ciclo di Krebs (avviene nella matrice): l’acetil-CoA è ossidato a CO₂ – produzione di (NADH e FADH₂) – Produzione di due molecole di ATP;
4. Catena di trasporto degli elettroni e fosforilazione ossidativa (avviene sulle creste) –: trasferimento degli elettroni dal NADH e dal FADH2; creazione del gradiente protonico e sua utilizzazione da parte delle FoF1 per produrre ATP – Produzione di 32 molecole di ATP.

In figura: schema della respirazione cellulare aerobica- la demolizione del glucosio produce 36 molecole di ATP. Immagine da
Università degli studi di Roma 2

Mitocondri – glicolisi aerobica

La glicolisi aerobia si svolge nel citoplasma, fuori dai mitocondri. Attraverso una serie di reazioni, i cui dettagli vengono dati in specifici corsi, il glucosio ( molecola a sei atomi di carbonio) viene scisso in due molecole di acido piruvico ( molecola a tre atomi di carbonio).
Nella glicolisi vengono idrolizzate due molecole di 2ATP ⇒ 2ADP, mentre ne vengono prodotte
quattro 4ADP ⇒ 4ATP. Il bilancio netto della glicolisi è la produzione di due molecole di ATP. Da notare che nella glicolisi vengono prodotte due NADH (accettori di elettroni diffusibili ad alto contenuto energetico)
In figura: le reazioni delle glicolisi aerobia. Immagine modificata da University of Illinois at Chicago

Mitocondri – formazione dell’aceti CoA – Ciclo di Krebs

L’acido piruvico prodotto nella glicolisi viene traslocato nella matrice mitocondriale dove è ossidato ad acetil-CoA.
L’acetil-CoA entra nel ciclco di Krebs ( o dell’acido citrico). La maggior parte l’energia prodotta dalla demolizione dei legame C-C e C-H viene trasferita agli accettori di elettroni diffusibili, il NADH e il FADH₂.
In figura: formazione dello acetil-CoA e reazioni del Ciclo di Krebs. Immagini da Università degli studi di Pavia

Mitocondri – Ciclo di Krebs crocevia di vie cataboliche

Il ciclo di Krebs è una tappa cruciale delle sostanze ingerite con l’alimentazione. La degradazione degli zuccheri, dei grassi e delle proteine conducono alla formazione di acetil–CoA che entra nel ciclo di Krebs.

Mitocondri – fosforilazione ossidativa

Le molecole di NADH e di FADH₂ prodotte nel ciclo di Krebs (e nella glicolisi) cedono gli elettroni alla catena di trasporto degli elettroni che è una serie di complessi di proteine presenti sulla membrana interna.
Gli elettroni catturati dal NADH e FADH₂ sono trasferiti attraverso questi complessi i quali sono accoppiati con pompe protoniche.
Le pompe protoniche generano un gradiente trasferendo ioni H⁺ nello spazio intermembrana.
Il gradiente protonico è utilizzato dalla ATP sintetasi per produrre ATP (ADP → ATP).
Nel sito Virtual Cell Animation Collectionsi può osservare una animazione della fosforilazione ossidativa.
In figura: schema della fosforilazione ossidativa.Immagine da:University of Miami

Mitocondri – bilancio energetico del metabolismo aerobico

Nel metabolismo anaerobico vengono prodotte solo due molecole di ATP. Il bilancio del metabolismo aerobico è di gran lungo maggiore. Vengono, infatti, prodotte 36 molecole di ATP: due nella glicolisi, 2 nel ciclo di Krebs, 32 nella fosforilazione ossidativa.

Il rendimento è superiore a quello di qualsiasi motore (circa il 40 % ):

Glucosio + O₂ a CO₂ + H₂O + 680 Kcal/mol

36 ATP ⇒ 36 ADP +36 Pi + 36x 7,3= 262,8 Kcal/mol

Resa %= 262,8/680 = 38,9%

In figura: bilancio energetico del metabolismo aerobico. Immagine da Ricerche di scienze

Mitocondri – ulteriori funzioni

Altre funzioni dei mitocondri sono:

• accumulo di ioni calcio;
• produzione di calore (i mitocondri delle cellule del tessuto adiposo bruno, abbondante negli animali ibernanti posseggono nella membrana interna dei mitocondri una proteina che disaccoppia la F₁ dalla F₀. L’energia del gradiente protonico generato dalla catena di trasporto di elettroni è dissipato sotto forma di calore;
• apoptosi (I mitocondri giocano un ruolo fondamentale nella morte cellulare innescando una delle vie dell’apoptosi (quella intrinseca), che porta al rilascio di fattori apoptogenici dallo spazio intermembrana tra cui il citocromo c).

In figura: rappresentazione schematica del rilascio del Citocromo C quale fattore apoptogenico. Immagine da Blogspot