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Olimpia Pepe » 3.Cenni di microscopia


Visualizzazione dei microrganismi

Gran parte dei microrganismi sono troppo piccoli per essere osservati ad occhio nudo e, quindi, la loro visualizzazione richiede l’uso del microscopio ottico o del microscopio elettronico.

Zacharias Jansen (XVI e XVII secolo) sembra abbia sviluppato per primo il microscopio ottico composto definito così per la presenza di due lenti interposte fra l’occhio e l’oggetto da osservare.

Il microscopio ottico composto in campo chiaro permette l’osservazione di un’immagine scura su uno sfondo luminoso, grazie alle differenze di contrasto (capacità delle cellule di assorbire o disperdere la luce) esistenti fra gli stessi e il mezzo circostante.

Molte cellule batteriche sono difficilmente osservabili in campo chiaro per il basso contrasto con il mezzo circostante mentre negli organismi pigmentati il colore aggiunge contrasto rendendoli facilmente osservabili (Fig. 1). Per aumentare il contrasto si possono colorare le cellule microbiche o le strutture batteriche mediante colorazioni differenziali (es. Gram reazione) o semplici (Fig. 2).

Esistono diversi tipi di microscopi ottici: in campo chiaro, a contrasto di fase, in campo oscuro e ad interferenza.

Fig. 1. Osservazione di un microrganismo pigmentato (microscopia in campo chiaro)

Fig. 1. Osservazione di un microrganismo pigmentato (microscopia in campo chiaro)

Fig. 2. Osservazione di cellule colorate (colorazione semplice)

Fig. 2. Osservazione di cellule colorate (colorazione semplice)


Microscopio ottico composto

La parte meccanica del microscopio ottico (Fig. 3) è costituita dallo stativo formato da una base pesante ed un braccio, su cui sono inserite tutte le altre parti del microscopio. Lo stativo dona stabilità allo strumento e racchiude tutti i delicati meccanismi di regolazione del microscopio (Fig. 3).

Nel braccio sono inserite le manopole per la messa a fuoco grossolana (macrometrica e per la messa a fuoco di precisione (micrometrica) che muovono il tavolino portaoggetti o il portaobiettivi in modo da focalizzare l’immagine (Fig. 4).

Il tavolino sorregge i vetrini da esaminare che sono bloccati mediante dei fermi (Fig. 3) e porta montato al di sotto il sistema di lenti del condensatore (Fig. 5).

La base porta la sorgente luminosa formata da una lampada elettrica a bassa tensione regolabile mediante un reostato, incorporata in tutti i moderni microscopi, anche i più semplici (Fig. 4).

La luce che si origina dalla lampada in basso attraversa le varie lenti del microscopio (condensatore, obiettivo e oculare) fino a raggiungere l’occhio. Un sistema di lenti convergenti, detto obiettivo, ingrandisce l’oggetto, la cui immagine viene ulteriormente ingrandita da un secondo sistema di lenti, detta oculare (Fig. 4).

Lez. 3, Fig. 3 in Madigan M. T., Martinko J. M., Brock. Biologia dei microrganismi, CEA, Fig. 4-1 pag 57 vol.1 (per metà)

Fig. 4. il percorso della luce in un microscopio ottico

Fig. 4. il percorso della luce in un microscopio ottico


Il condensatore

Il condensatore è un sistema di lenti con la funzione di inviare all’obiettivo la quantità di luce adatta alle sue caratteristiche ottiche. Deve essere regolabile in altezza e lo si deve poter centrare. Il condensatore è sempre provvisto di un diaframma ad iride (diaframma di apertura) per poter regolare l’ampiezza del cono di luce che entra nell’obiettivo (Fig. 5).

Fig. 5. Condensatore con diaframma ad iride

Fig. 5. Condensatore con diaframma ad iride


Gli obiettivi

Nella parte superiore del braccio sono montati gli obiettivi che sono sistemi di lenti convergenti (Fig. 6) che danno la prima immagine ingrandita del campione. Essi sono gli elementi ottici del microscopio da cui, in larga misura, dipendono le principali caratteristiche dello strumento e la sua resa qualitativa.

Sono avvitati su un portaobiettivo a revolver (Fig. 7), che ne porta fino a sei a diverso ingrandimento.

Il valore dell’ingrandimento è inciso sulla montatura assieme ad altri importanti parametri. Ad esempio, gli obiettivi della figura hanno un potere di ingrandimento da 20x, 40x, 60x e 100x e devono essere usati con vetrini coprioggetto di 0,17 mm di spessore (Fig.7).

Sono, inoltre, indicati i valori dell’apertura numerica dei diversi obiettivi.

Fig. 6. Sistema di lenti dell’obiettivo

Fig. 6. Sistema di lenti dell'obiettivo

Fig. 7. Obiettivi montati su un portaobiettivi a revolver

Fig. 7. Obiettivi montati su un portaobiettivi a revolver


Gli oculari

L’oculare può essere unico oppure doppio, per una osservazione più comoda.

L’oculare porta inciso un numero sulla montatura che indica il suo potere di ingrandimento (Fig. 8).

Questo valore, moltiplicato per l’ingrandimento dell’ obiettivo, dà l’ ingrandimento totale del microscopio nell’ osservazione visiva.

Fig. 8. Oculare con inciso sulla montatura il proprio ingrandimento

Fig. 8. Oculare con inciso sulla montatura il proprio ingrandimento


Ingrandimento dell’immagine

Il microscopio ottico utilizza il sistema di lenti dell’obiettivo per indirizzare e focalizzare i raggi luminosi in modo da produrre un’immagine ingrandita di oggetti molto piccoli.

L’occhio umano può essere considerato un microscopio semplice. Come mostrato nella Fig. 9, l’immagine di un oggetto (Ob) formata sulla retina, è più piccola quando questo è lontano dall’occhio (Im1) rispetto a quando lo stesso oggetto è più vicino (Im2).

Oggetti di dimensioni inferiori a 0,1 mm (es. i batteri hanno un diametro di circa 0.001 mm) non possono essere osservati distintamente in quanto essi non occupano un’area sufficientemente grande sulla superficie retinica. Il loro ingrandimento per mezzo del microscopio ne permette la loro osservazione.

L’osservatore mette a fuoco l’oggetto regolando la distanza tra la lente dell’oculare e quella dell’obiettivo fino a che non si forma un’immagine nitida. Nel diaframma oculare del microscopio si forma un’immagine reale ingrandita e capovolta rispetto all’oggetto. L’occhio percepisce un’immagine virtuale ingrandita e dritta rispetto all’oggetto (Fig. 10)

Fig. 9. Microscopio semplice: ingrandimento dell’immagine nell’occhio umano

Fig. 9. Microscopio semplice: ingrandimento dell'immagine nell'occhio umano

Fig. 10. Formazione dell’immagine nel microscopio ottico composto

Fig. 10. Formazione dell'immagine nel microscopio ottico composto


Ingrandimento del microscopio

Il sistema di lenti convergenti dell’obiettivo, ingrandisce l’oggetto, la cui immagine viene ulteriormente ingrandita da una secondo sistema di lenti dell’ oculare.

L’ingrandimento totale di un microscopio ottico nell’osservazione visiva, è dato dal prodotto dell’ingrandimento proprio dell’obiettivo e quello dell’oculare (Fig. 11).

Il microscopio ottico composto permette di ottenere un ingrandimento utile massimo di circa 1000-1500 X (volte).

La massima risoluzione di un microscopio ottico è 0,2 μm. Un ingrandimento superiore fornice un’immagine sfuocata per via della proprietà fisica nota come risoluzione o potere di risoluzione.

Fig. 11. Calcolo dell’ingrandimento totale di un microscopio ottico

Fig. 11. Calcolo dell'ingrandimento totale di un microscopio ottico


Potere di risoluzione

In teoria la massima risoluzione di un microscopio ottico è 0,2 μm quindi due oggetti che si trovano ad una distanza inferiore l’uno dall’altro non possono essere osservati distintamente ma appaiono come oggetto unico o come dischi sovrapposti (Fig. 12).

Il potere di risoluzione del microscopio ottico è la distanza minima (d) che deve intercorrere tra due punti dell’oggetto per poterli distinguere come separati e fornire un’immagine particolareggiata dell’oggetto che si sta osservando.

Il potere di risoluzione (d) è funzione della lunghezza d’onda della luce utilizzata (λ) e di una proprietà caratteristica dell’obiettivo conosciuta come apertura numerica (n sen θ) (Fig. 13).

L’apertura numerica (n sen θ) è un valore tipico proprio di ogni obiettivo. Essa è data dal prodotto dall’indice di rifrazione (n) del mezzo interposto fra il preparato e la lente frontale dell’obiettivo, e l’apertura angolare (θ) (Fig. 13), che rappresenta l’ampiezza angolare del cono di raggi di luce raccolti dalla lente dell’obiettivo e provenienti dal campione (Fig. 14).

Fig. 12. Potere di risoluzione del microscopio ottico

Fig. 12. Potere di risoluzione del microscopio ottico

Fig. 13. Formula per il calcolo del potere di risoluzione del microscopio ottico

Fig. 13. Formula per il calcolo del potere di risoluzione del microscopio ottico


Potere di risoluzione

Il potere di risoluzione (d) del microscopio è maggiore quando si utilizza luce nello spettro del blu (lunghezza d’onda più breve pari a 500 nm) e obiettivo con un’apertura numerica elevata.

L’indice di rifrazione dell’aria è 1, quello dell’olio da immersione è 1,5. Il valore massimo di sen θ è 1 (sen 90°).

L’apertura numerica (n sen θ) può essere aumentata utilizzando diversi mezzi. L’immersione in olio aumenta l’indice di rifrazione (n) e l’apertura angolare (θ). Ciò determina una diminuzione della distanza minima di risoluzione (d) di due oggetti osservabili nel campo visivo e, in pratica, un miglioramento del potere di risoluzione del microscopio (Fig. 14).

Fig. 14. Modificazione dell’apertura angolare con l’immersione omogenea e non omogenea

Fig. 14. Modificazione dell'apertura angolare con l'immersione omogenea e non omogenea


Altri microscopi

Microscopio in campo oscuro

Le cellule viventi prive di pigmenti non sono chiaramente visibili al microscopio in campo chiaro per la scarsa differenza di contrasto esistente tra le cellule e l’acqua (Fig. 15a). Il microscopio in campo oscuro si ottiene collocando un diaframma per campo oscuro sotto il sistema delle lenti del condensatore di un microscopio ottico. In questo modo si crea un cono di luce cavo che colpisce l’oggetto e solo la luce riflessa e rifratta proveniente dal campione formerà l’immagine. Così le cellule del campione appariranno chiare su uno sfondo scuro. Tale tecnica permette di migliorare le differenze di contrasto tra le cellule e il mezzo circostante evitando di usare l’uso di colorazioni (Fig. 15b). Il microscopio a contrasto di fase trasforma piccole differenze dell’indice di rifrazione e della densità cellulare in variazioni dell’intensità luminosa facilmente individuabili (Fig 15c). Esso risulta molto utile per lo studio delle cellule eucariotiche e per mettere in evidenza le diverse componenti batteriche come le endospore e le inclusioni citoplasmatiche. Nella microscopia a fluorescenza il campione colorato con coloranti fluorescenti (fluorocromi) o dotato di fluorescenza naturale (autofluorescenza) esposto a luce con bassa lunghezza d’onda (luce ultravioletta), emette luce a lunghezza d’onda superiore. Un condensatore per campo oscuro consente di osservare l’oggetto fluorescente che brilla sopra uno sfondo scuro (Fig 16).

Lez. 3, Fig. 15 in Madigan M. T., Martinko J. M., Brock. Biologia dei microrganismi, CEA, Fig. 4-5 pag 60 vol.1

Fig. 16. Osservazione a fluorescenza di batteri e alghe

Fig. 16. Osservazione a fluorescenza di batteri e alghe


I materiali di supporto della lezione

Madigan et al., Cap 4

Perry et al., Cap 4

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