Gaetano Odierna » 5.Principali metodi istochimicici, immuno-istochimici, colture in vitro, autoradiografia

Principali tecniche istochimiche

L’Istochimica comprende le reazioni chimiche che si utilizzano per la localizzazione cellulare e tissutale dei vari costituenti, e in particolare dei lipidi, dei polisaccaridi, delle proteine e degli acidi nucleici).

Figura A: Nuclei e cromosomi di una anfibio anuro colorati con il DAPI, un fluorocromo che lega le basi AT del DNA

Figura B: Cellula renale della linea Ptk colorati con anticorpi contro proteine nucleari (in verde), mitocondriali (in rosso) e actina filamentosa (in blu). Da: Nikon MicroscopyU Fluorescence Microscopy Digital Image Gallery

Figura C: Coniglio con cellule della pelle modificate con la GFP. I cheratinociti, cellule dell’epidermide, di questo coniglio sono state modificate in modo da far esprimere la GFP, una proteina naturale di una specie di medusa. Tale proteina dà una intensa fluorescenza verde quando viene eccitata ad una specifica lunghezza d’onda.

Reazioni per i lipidi

Nella comune tecnica delle fette i grassi e i lipidi contenuti nelle cellule vengono estratti (Fig. A). Pertanto, per il loro studio si usano sezioni istologiche ottenute con il criostato o con il microtomo congelatore. In tali sezioni i lipidi vengono evidenziati mediante coloranti liposolubili (ad esempio il sudan nero, il sudan III o il rosso congo). Tali coloranti si sciolgono nei grassi contenuti nelle cellule grazie alla maggiore affinità verso i grassi rispetto al solvente in cui sono disciolti, in genere alcool etilico (Fig. B e C)
Principali tecniche istochimiche: reazioni per i lipidi

Fig. A: Sezione di tessuto adiposo, incluso in pariffina, colorata con Emallume – Eosina. Gli adipociti appaiono come grosse vescicole incolori.

Fig. B: Schema di una cellula adiposa o adipocita colorata con il Sudan nero. I grassi occupano tutto il citoplasma.

Fig. C: Sezione al crisostato di tessuto adiposo colorata con Rosso Congo.

Principali tecniche istochimiche: PAS-reazione per i polisaccaridi neutri

La PAS (Periodic Acid Schiff) è una reazione che evidenzia i polisaccaridi neutri (glicogeno, mucina). I gruppi ossidrili (-OH) degli zuccheri sono ossidati dall’acido periodico (Periodic Acid) con la formazione gruppi aldeidici (-CHO). Il reattivo di Schiff (che è incolore) reagisce con tali gruppi virando a rosso-magenta

Fig. A e B: Schema di una cellula epatica (A) e immagine di una sezione di un lobo epatico (B) – i granuli di glicogeno presenti negli epatociti in seguito alla Reazione PAS risultano colorati in rosso-magenta.

Principali tecniche istochimiche: metacromasia

• La colorazione è ortocromatica quando il colorante colora il substrato con lo stesso colore che ha in soluzione;
• La colorazione si dice metacromatica quando il colorante colora il substrato con un colore diverso da quello che ha in soluzione. Tale fenomeno si osserva per alcuni coloranti basici, come ad esempio il blù di tuolidina, che colora in viola (metacromaticamente) i GAG – GlicosoAmminoGlicani, una particolare classe di polissaccaridi acidi.

Le molecole di blu di tuolidina, legando i gruppi acidi dei GAG, risultano ad una distanza tale da consentire la loro polimerizzazione. Ciò modifica la struttura molecolare del colorante e conseguentemente il suo spettro di assorbimento della luce.

Fig. A: Sezione di intestino colorata blu di tuolidina. Tale colorante colora ortocromaticamente i nuclei e il citoplasma degli enterociti e delle cellule mucipare, mentre colora metacromaticamente in viola le vescicole di muco di cui è infarcito il citoplasma delle cellule mucipare.

Principali tecniche istochimiche: Colorazioni per gli Acidi nucleici

Verde Metile – Pironina

Il verde metile lega specificamente il DNA colorandolo in verde. La pironina è aspecifico perché colora in rosso sia l’RNA sia le proteine (Fig. A). Tuttavia, con il test di Brachet la colorazione diventa specifica. Tale test consiste nel trattare una sezione sucessiva a quella colorata con il Verde Metile-Pironina, con la RNasi, un enzima che degrada l’RNA (Fig.B)

Acridina-orange o arancio d’acridina

E’ un colorante fluorescente che lega in modo specifico gli acidi nucleici, colorando in verde le molecole a doppio filamento (il DNA) e in rosso quelle a singolo filamento (l’RNA) (Fig. C).

Se durante la preparazione del campione il DNA viene accidentalmente denaturato risulterà anch’esso colorato in rosso, in quanto a singolo filamento.

Principali tecniche istochimiche: Colorazioni specifiche per il DNA

Reazione di Feulgen

E’ specifica e stechiometrica per il DNA.

Il DNA è idrolizzato a caldo con acido cloridrico (pochi minuti a 60 °C). Tale trattamento stacca le purine dal desossiribosio che può passare nella forma lineare aldeidica. Ai gruppi aldeidici liberati si lega il reattivo di Schiff, che vira al rosso magenta.

La reazione è stechiometrica in quanto l’intensità del colore è proporzionale alla quantità di DNA presente nel nucleo. Tale valore si indica con la lettera C ed è espresso in pg per Nucleo (C=pg/N). Nelle cellule somatiche la quantità di DNA nucleare è 2C; nell’uomo 2C=7.0 pg/N

Principali tecniche istochimiche: Fluorocromi base specifici per il DNA

Alcune sostanze fluorescenti colorano il DNA legandosi specificamente alle coppie di basi AT o GC. Tra i fluorocromi AT specifici i più usati sono la quinacrina (fig. A e D) e il DAPI (fig. B e E); la Cromomicina A3 ( CMA3) (Fig. C e F) tra quelli GC specifici.

Reazioni per la localizzazione delle proteine

A parte alcune reazioni chimiche storiche basate sulla reattività dei radicali di alcuni amminoacidi, quali ad esempio il gruppo fenolico della tirosina o quello sulfidrilico (-SH) della cisteina, usate per la localizzazione generica delle proteine cellulari e tissutali, attualmente si preferiscono utilizzare reazioni istochimiche o immunoistochimiche per la localizzazione di specifiche proteine. In particolare, le reazioni istochimiche si applicano per la individuazione cellulare e/o tissutale delle proteine ad attività enzimatica. Tali reazioni sfruttano il(i) prodotto(i) della reazione catalizzata da uno specifico enzima facendolo reagire con un dato substrato in modo da formare un prodotto di reazione visibile in microscopia ottica e/o elettronica. Ad esempio la fosfatasi acida catalizza la seguente reazione: R-O-PO₃^{- -} + H₂O →pH5→ R-OH + HO-PO₃^{- -}

Il gruppo fosfato prodotto reagisce con il citrato di piombo: HO-PO₃^{– –} + Citrato-Pb → acido citrico + ↓ Pb₃(P0₄)₂ formando il fosfato di piombo che è insolubile e dà un precipitato nero, visibile in Microscopia ottica ed, essendo il piombo elettrondenso, anche in microscopia elettronica.

Fig. A: Reazione per la fosfatasi acida. Notare la positività della reazione (precipitato nero) circoscritta alle vescicole lisosomiali.

Immunoistochimica

Grazie allo sviluppo di metodi e strumenti di indagine sempre più potenti l’immunoistochimica, attualmente, è la tecnica preferenziale per l’individuazione di specifici componenti cellulari o tissutali. Tale metodica fa uso di anticorpi che agiscono selettivamente contro un determinato componente cellulare o tissutale (antigene). Si possono usare contemporaneamente più anticorpi diretti contro differenti sostanze e marcati con molecole fluorescenti diverse. Ciò consente di visuliazzare la reciproca localizzazione degli antigeni (vedi figura).

Fig. A: Cellula renale della linea Ptk colorati con anticorpi marcati contro proteine nucleari (in verde), mitocondriali (in rosso) e contro actina filamentosa (in blu). Da: Nikon MicroscopyU Fluorescence Microscopy Digital Image Gallery

Immunoistochimica: metodo diretto

Nel metodo diretto l’anticorpo è marcato con una sostanza rilevatrice (un enzima, un fluorocromo, o un metallo pesante) così da consentire la localizzazione dell’antigene coi diversi tipi di microscopi.

In microscopia ottica si usano anticorpi marcati in genere con perossidasi ed usando come substrato l’acqua ossigenata e la diaminobenzidina. Il colore rosso-ruggine, che si sviluppa in seguito all’azione dell’enzima sul substrato, localizza l’antigene. In microscopia elettronica è il metallo pesante (elettondenso) legato all’anticorpo a localizzare l’antigene (Fig. A).

Nel microscopio a fluorescenza si usano anticorpi legati con un fluorocromo (ad esempio fluorosceina). Quando il fluorocromo è eccitato ad una specifica lunghezza d’onda, emette una luce fluorescente (verde nel caso della fluorosceina), che localizza in tal modo l’antigene (Fig. B).

Immunoistochimica: metodo indiretto

Nel metodo indiretto l’anticorpo diretto contro la sostanza da rilevare non è marcato ed è detto primario. Tale anticorpo è a sua volta riconosciuto da un altro anticorpo, ovvero da un anticorpo-anti anticorpo, che è detto secondario ed il quale è marcato con uno enzima o con un fluorocromo. Tale metodo è più potente rispetto a quello indiretto perché il segnale di rilevamento è più intenso, in quanto all’anticorpo primario possono legarsi più anticorpi secondari.

Istochimica: lectine per l’identificazione di polisaccaridi delle superfici cellulari

La scoperta che le proteine di origine vegetali della famiglia delle lectine legano ciascuna uno specifico residuo zuccherino (ad esempio glucosio, fucosio, galattosio, acido sialico etc.) ha dato un notevole impulso allo studio dei polisaccaridi di superficie della membrana cellulare e dei compartimenti interni e dei meccanismi in cui tali polisaccaridi sono coinvolti, ad esempio l’adesione e il riconoscimento cellulare. Tale metodica fa uso di specifiche lectine coniugate con un opportuno marcatore (perossidasi, metallo pesante, un fluorocromo) consentendo così la localizzazione delle glicoproteine di superficie in microscopia ottica, elettronica e a fluorescenza.

Colture in vitro

Le colture in vitro costituiscono degli utili sistemi in cui le cellule, tessuti o organi, espiantati dall’organismo, continuano a svolgere le loro funzioni per un periodo di tempo, che può essere in taluni casi anche illimitato (linee clonali perenni). L’utilità di tali sistemi è ovvia, potendo studiare le condizioni e i parametri che regolano la crescita delle differenti linee cellulari.

Le colture cellulari si impiantano in condizioni di rigorosa sterilità a partire da frammenti di tessuti.

Da tali frammenti le cellule sono dissociate e seminate in specifici terreni di coltura, contenuti, in genere, in fiasche o capsule. Qui le cellule aderiscono sul fondo e crescendo per mitosi formano monostrati cellulari (Figura)

Colture cellulari: principi di allestimento

I terreni e le condizioni fisiche delle colture cellulari differiscono a secondo se si opera con cellule vegetali o animali, e per gli ultimi se si opera con cellule di pesci, anfibi, rettili, uccelli o di mammiferi. I terreni di coltura in genere sono quelli sintetici, i quali contengono definite quantità di sostanze fondamentali (amminoacidi, zuccheri, vitamine, sali inorganici, ecc.) sciolti in soluzione a pH, a pressione osmotica controllate. L’allestimento delle colture, indipendentemente dall’organismo considerato, prevede esecuzione di tappe comuni: frammentazione del tessuto e dissociazione delle cellule in esso contenuto mediante breve digestione con tripsina; semina delle cellule in uno specifico terreno di coltura e loro crescita in condizioni fisiche controllate; distacco delle cellule giunte a confluenza mediante blanda tripsininazzione; allestimento di nuove colture (subcolture) (schema).

La coltura allestita a partire dal tessuto è detta primaria, le successive vengono indicate numeri crescenti. Il numero delle sottocolture non è indefinito, dopo un dato numero di sottocolture, variabile a secondo del tessuto e della specie oggetto di studio, la crescita si arresta (invecchiamento cellulare), a meno che le cellule, per accumulo di mutazioni genetiche, si trasformano in linee cellulari continue (neoplastiche), le quali acquisiscono anche la capacità di crescere in più strati, sfuggendo quindi al fenomeno dell’inibizione da contatto.

Autoradiografia

Tale metodica fa uso di isotopi radioattivi. In citologia ed istologia in genere si usa il trizio, ³H.

Tale isotopo emette radiazioni β a bassa energia, i quali hanno una scarsa penetrazione e, in genere, vengono schermati dopo aver percorso pochi micron.

I raggi b emessi dal ³H impressionano i sali di argento (AgBr) di un’emulsione fotografica, in precedenza distesa sulla sezione istologica. Il vetrino è tenuta al buio e dopo alcuni giorni, si procede allo sviluppo e al fissaggio. Al microscopio ottico o elettronico si visualizzano le cellule o i compartimenti cellulari positivi per grani di Ag impressionati dai raggi β (vedi schema).

Autoradiografia – pulse and chase

Con l’isto-autoradiografia è possibile seguire il destino della molecola (amminoacido, zucchero, base azotata) in cui il ³H è stato inserito in sostituzione di un atomo di H, eseguendo sezioni del tessuto intervallate nel tempo e monitorando i grani di argento depositato. Il procedimento consiste nell’esporre per un breve tempo (pulse) le cellule, il tessuto o un organo ad un mezzo di coltura contenente una molecola marcata con ³H in luogo di una normale. Segue il lavaggio (chase) con un terreno normale e a definiti intervalli di tempo si preleva il campione e si procede all’isto-autoradiografia. Di seguito è schematicamente riportata la via delle secrezione ricostruita a partire da immagini istoautoradiografiche di pulse and chase a 1, 3, 10 e 30 minuti della leucina marcata con ³H (³H-leu) somministrata a cellule del pancreas esocrino. I grani di Argento (•) sono localizzati dapprima sul Reticolo endoplasmatico rugoso, poi sull’apparato del Golgi, nelle vescicole citoplasmatiche e infine nella porzione apicale e all’esterno della cellula.

Metodiche di fluorescenza in vivo- la GFP e i suoi derivati

La GFP (proteina verde fluorescente) è una proteina naturale di una specie di medusa, l’Aequoria victoria, che, eccitata ad una lunghezza d’onda intorno ai 480 nm, dà una intensa fluorescenza verde. Tale proteina legata covalentemente ad altre proteine, o espressa nelle cellule di altri organismi in seguita a trasfezione del gene della GFP, non interferisce con la normale attività della molecola a cui è legata. Eccitando la GFP a determinati intervalli di tempo si ha la possibilità di seguire al microscopio a fluorescenza o a quello confocale in vivo la via metaboliche di determinate proteine o la loro espressione durante lo sviluppo ontogenetico di un organismo. Inoltre, sono stati sviluppati varianti della GFP la cui fluorescenza è stata rafforzata (EGFP) o modificata in giallo (EYFP) o in azzurrognola (ECFP). La fluorescenza in rosso è data dalla proteina DsRed2FP, che, più recentemente, è stata isolata dal Discosoma striata, una specie di corallo. L’uso contemporaneo di tali proteine fluorescenti consentono di poter studiare contemporaneamente la localizzazione nel tempo e nello spazio di più molecole o compartimenti cellulari (vedi figura).

Fig. A: Nell’immagine sono visualizzati contemporaneamente: i nuclei in blu tramite la ECFP; i motocondri in giallo con la EYFP; la membrana plasmatica in verde mediante la EGFP e i cloroplasti in rosso, tramite la DsRed2FP. Da Lam et al. Annu. Rev. Plant Biol. 2004. 55:537–554

Videomicroscopia digitale computerizzata

Un ulteriore avanzamento in Citologia ed Istologia è avuto tramite lo sviluppo della videomicroscopia digitale computerizzata. Le immagini vengono acquisite da sensibilissime videocamere ad alta risoluzione. Le immagini vengono digitalizzate, convertite in bianco-nero e le differenze di tonalità di grigio (250 diverse tonalità) rafforzate al computer tramite sofisticati programmi di analisi di immagini. Un esempio di tale potenzialità è riportato nelle figure, che sono relative alla risoluzione di elementi subcellari, in particolare di microtubuli, non visibili o scarsamente definiti quando osservati al microscopio.

Fig. A, B, C, D: L’immagine in (a) come osservata al microscopio dopo conversione in tonalità di grigio. In tale immagine dopo aver sottratto gli elementi del fondo (b), appaiono visibili gli elementi microtubulari (c), i quali, dopo una ulteriore elaborazione, appaiono ben contrastati e definiti (d). Da Becker et al. Il mondo della cellula. Edises Editore (2002)