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Serena Calabrò » 8.Principali tecniche di analisi strumentale

Le soluzioni strumentali di un problema analitico

Vantaggi rispetto alle analisi classiche:
- + rapide e – laboriose dal punto di vista della manualità;
- + sensibili (- errori sistematici, risultato + accurato);
- + precise (errori di minore entità);
- possibilità di analizzare i componenti di una miscela chimica complessa (a volte prima si devono separare i composti).

La natura e la concentrazione di un composto chimico viene determinata per via strumentale sfruttando particolari proprietà fisiche, che vengono misurate con opportune strumentazioni. Alcune proprietà sono specifiche e permettono una determinazione quantitativa e qualitativa nello stesso tempo (es. NIRS), altre meno (es. conducibilità elettrica).

Classificazione delle analisi strumentale in base alle proprietà fisiche:
- Metodi elettrochimici.
- Metodi radiochimici.
- Metodi termochimici.
- Metodi ottici e spettroscopici.
- Metodi cromatografici.

Le fasi di una misura strumentale

Il processo mediante cui si ottiene una misura è un atto essenziale dei metodi strumentali ed è costituito da differenti fasi, che sono nell’ordine, generalmente, le seguenti:
- produzione di un segnale (misura vera e propria);
- rivelazione e trasformazione del segnale (l’eccitazione iniziale è trasformata in un segnale elettrico);
- amplificazione e trasmissione;
- calcolo automatico dell’intensità del segnale;
- presentazione e registrazione.

Spettrofotometria

“Spettroscopia” significa “osservazione dello spettro”.
Questo tipo di analisi ha il suo fondamento nell’interazione tra le radiazioni elettromagnetiche e la materia da analizzare.
In particolare, permette di ricavare informazioni quantitative e qualitative sulla sostanza in esame studiando la natura e l’intensità delle onde elettromagnetiche che la sostanza stessa, in adatte condizioni sperimentali, è in grado di emettere (spettrometria di emissione) o di assorbire (spettrometria di assorbimento → spettrofotometria).
Un campione irradiato assorbe l’energia selettivamente in funzione della specifica frequenza di vibrazioni delle molecole presenti, creando così lo spettro di assorbimento.
Lo spettro di un campione può consistere in un picco di bande di assorbimento dal quale è possibile identificarne tutti i componenti.
Le vibrazioni fondamentali riguardano legami OH, CH e NH, caratterizzati da una larga anarmonicità, tipica del leggero atomo di idrogeno.

Energia delle radiazioni

In spettrofotometria si impiegano radiazioni nell’intervallo 200-1100 nm, la cui energia è sufficiente ad attivare transizioni elettroniche, che causano il passaggio di elettroni degli strati esterni a stati eccitati:
- UV (Ultravioletto) ⇒ 200-400 nm (lontano UV);
- Visibile (vis) ⇒ 400-800 nm;
- NIR (Near Infrared) ⇒ 800-1100 nm (vicino IR).

Zone dello spettro elettromagnetico che interessano la spettrometria analitica

Zone dello spettro elettromagnetico che interessano la spettrometria analitica (segue)

La spettroscopia ultravioletta (UV-vis) è una tecnica strumentale che misura l’assorbimento di radiazione elettromagnetica nella zona del visibile-ultravioletto da parte dei composti analizzati per fornire informazioni di tipo sia qualitativo che quantitativo.
L’intervallo spettrale in cui si collocano le radiazioni ultraviolette va da 10 a 380 nm, mentre la zona del visibile è compresa tra 380 e 780 nm; dal punto di vista analitico, la regione più interessante riguarda l’UV vicino ed il visibile (200-780 nm)
La caratteristica fondamentale e distintiva di una radiazione elettromagnetica è la sua lunghezza d’onda (λ) che viene definita come la distanza misurata lungo la linea di propagazione, tra due punti in fase su onde adiacenti.

Principio di funzionamento

Gli elettroni di legame di un composto, sia organico che inorganico, possono effettuare passaggi tra i vari livelli elettronici a spese dell’energia fornita loro dalla radiazione elettromagnetica.
Le molecole che compongono il campione assorbono l’energia irradiata se essa è in quantità sufficiente per far vibrare i loro gruppi funzionali (visibile, IR) oppure per promuovere transizioni elettroniche (UV, visibile)
La risposta del campione viene registrata e, in base ai segnali raccolti, è possibile risalire alla composizione del campione in termini di molecole.
Il tipo di interazione fornisce la risposta analitica:
- qualitativa ⇒ identificazione attraverso le λ assorbite;
- quantitativa ⇒ calibrazione con soluzioni a concentrazione nota.

Le transizioni possibili sono diverse e la loro osservabilità nel campo UV-vis dipende dalla differenza di energia esistente tra i due livelli in gioco.
Lo spettrometro UV-vis registra gli assorbimenti e li traduce in un grafico lunghezza d’onda (espressa in nm) – assorbimento (detto assorbanza).

Principio di funzionamento (segue)

Se le transizioni avvenissero solo tra livelli elettronici lo spettro UV sarebbe composto da una serie di linee, più o meno alte, ognuna delle quali rappresenterebbe una transizione; poiché però i livelli di energia elettronica sono a loro volta composti da sottolivelli di energia vibrazionale, i quali a loro volta sono suddivisi ancora più finemente in sottolivelli rotazionali, lo spettro UV-vis risulta in bande piuttosto allargate, dovute alle molteplici transizioni elettro-vibro-rotazionali che sono in effetti possibili.

Di queste bande si considerano per gli scopi analitici la lunghezza d’onda a cui si verifica il massimo assorbimento (lambda max) e il valore di assorbanza registrato in tale punto.16.

La legge dell’assorbimento

La legge sperimentale che descrive i fenomeni di assorbimento delle radiazioni elettromagnetiche prende il nome di legge di Lambert-Beer ed assume la forma:

A = ε · b · c

dove:
A = assorbanza (o densità ottica) → frazione di energia radiante assorbita
b = cammino ottico (in cm) → spessore della soluzione attraversata dal raggio
c = concentrazioni (in moli/l) della specie chimica in esame
ε = costante di proporzionalità, → assorbanza a spessore e concentrazioni unitari

ε prende il nome di assorbitività o coefficiente di assorbimento molare ed è in funzione della lunghezza d’onda della radiazione assorbita, del solvente e naturalmente della specie chimica che assorbe.
Fissato il valore di b (celle a spessore costante) l’equazione assume la forma A = k·c (cioè y = m·x), che in un sistema di assi cartesiani corrisponde ad una retta passante per l’origine, con m = coefficiente angolare
Se si lavora nel campo di linearità (concentrazioni basse,10-2-10-7 moli/litro) e a condizioni di temperatura, solventi e pH controllati, le analisi sono altamente riproducibili e affidabili, nonché di rapida esecuzione.

Strumentazione

Gli strumenti impiegati per misurare l’assorbimento delle radiazioni da parte di una soluzione sono chiamati spettrofotometri, che comprendono anche dispositivi più semplici detti colorimetri.
Gli spettrofotometri UV-vis sono estremamente diffusi per la loro semplicità di utilizzo, versatilità e basso costo.
La maggior parte degli strumenti ha un range strumentale limitato (180-800 nm), dove comunque quasi tutte le sostanze organiche presentano assorbimenti.
La registrazione dell’assorbimento di un determinato campione richiede una sorgente di radiazioni, un dispositivo in grado di selezionare le lunghezze d’onda più opportune (monocromatore) e, a valle del compartimento celle dove si mette il campione, un altro dispositivo in grado di misurare l’intensità della radiazione uscente (rilevatore); infine un opportuno indicatore fornisce i valori di assorbimento rilevati.

Strumentazione (segue)

Sorgente di radiazioni

Lampade a filamento di Wolframio (930-330 nm).
Lampade a quarzo-iodio p Wolframio-alogeno (400-300 nm).
Lampade al Deuterio (<400 nm).

Monocromatore

La sorgente luminosa emette radiazioni in tutte le direzioni dello spazio, è quindi necessario realizzare un opportuno sistema ottico (lenti, specchi, fenditure) che permetta di ottenere un fascio di luce ben focalizzato e sottile, che viene inviato al monocromatore, che si incarica di disperdere la luce policromatica in bande monocromatiche.
Filtri o prismi.

Strumentazione (segue)

Compartimento celle (cuvette)

Rettangolare in vetro, polistirene (monouso), quarzo (cammino ottico da 1 cm).
Cilindrica in vetro.
Rettangolare (cammino ottico da 4 cm).
Microcuvette per microcampioni (volume 0.5 ml).

Rilevatore

Trasforma l’energia radiante in un segnale elettrico che viene trasferito ad un indicatore analogico o digitale e, eventualmente, a un registratore.
I rivelatori di uso più comune nella regione UV-vis vengono chiamati cellule fotoelettriche e sfruttano l’elevata energia delle radiazioni in gioco.

Indicatore o registratore

La funzione dei sistemi di lettura consiste nel convertire il segnale che proviene dal rilevatore in una forma utilizzabile all’analista.
Il sistema è composto da una parte elettronica e da un quadrante (analogico o digitale) sul quale viene indicata la lettura effettuata.

Strumentazione (segue)

Tipi di strumento: la lettura dell’assorbanza di una soluzione deve tenere conto dell’inevitabile assorbimento dovuto sia alla soluzione in cui si trova la specie chimica da analizzare che al contenitore (cuvetta) in cui si trova la soluzione stessa.

Lo strumento va quindi azzerato con il bianco (= solvente con reattivi tranne la molecola che assorbe).
- Strumenti a mono-raggio: (es. colorimetri, fotometri) nella cella del campione si mette il bianco.
- Strumenti a doppio raggio: il dispositivo a doppio raggio consente di eliminare automaticamente le variazioni indesiderate del segnale che giunge al rilevatore; mentre un raggio legge il campione, il secondo misura l’assorbimento del bianco.

Spettroscopia ad assorbimento atomico

La spettrofotometria ad assorbimento atomico è una tecnica che permette di eseguire analisi di metalli, quantitative e qualitative, su un campione solido o in soluzione.
Quando un atomo viene posto nelle condizioni di acquistare energia elettromagnetica di intensità adeguata, uno o più elettroni possono abbandonare gli orbitali nei quali si trovano per venire promossi ad orbitali più ricchi di energia.
Di conseguenza l’atomo passa dallo stato energetico fondamentale a un livello energetico più ricco di energia e quindi meno stabile (stato eccitato); da questo stato eccitato l’atomo ricade rapidamente allo stato fondamentale, restituendo all’ambiente l’energia appena acquisita.
L’assorbimento energetico dell’atomo non è continuo ma quantizzato, per cui si ottengono spettri di righe; e poiché ogni atomo dispone di un proprio numero di elettroni, situati su determinati orbitali, è possibile registrare spettri di assorbimento atomico caratteristici costituiti da una serie di righe. Ad ogni riga corrisponde ad un salto energetico (l’energia assorbita per passare da un livello all’altro). Ogni riga ha lunghezze d’onda caratteristiche per ogni metallo, per cui è possibile l’identificazione qualitativa; l’intensità di energia assorbita è proporzionale al numero di atomi che passa dallo stato fondamentale a quello eccitato, per cui è possibile la determinazione quantitativa.

Spettrofotometro ad assorbimento atomico (AA)

Spettrofotometro ad assorbimento atomico (segue)

Lampada a catodo cavo

Gli ioni positivi del gas, accelerati dal campo elettrico, urtano il catodo e provocano l’espulsione degli atomi superficiali, con formazione di atomi vaporizzati che, eccitati dagli urti col gas di riempimento, emettono energia luminosa.

Chopper

La radiazione emessa passa attraverso un chopper e, grazie ad un sistema di specchi, si scinde in due raggi. Il primo attraversa la fiamma e si riunisce a quello di riferimento, quindi vengono entrambi mandati al monocromatore che seleziona la lunghezza d’onda da analizzare e li rimanda al detector che produce un’intensità di corrente proporzionale all’intensità del raggio incidente.

Lamapada a deuterio

Viene sfruttata la capacità, da parte di questa sorgente, di emettere uno spettro continuo di radiazioni nel campo dell’UV. L’assorbanza della radiazione del deuterio viene quindi sottratta da quella del fascio dell’analita.

Parti ottiche

Sistema di atomizzazione

Come si è visto l’assorbimento atomico utilizza la proprietà che hanno gli atomi allo stato fondamentale di assorbire determinate radiazioni. Quindi per avere l’assorbimento atomico si deve riuscire ad ottenere l’atomo neutro e “isolato”. L’atomizzazione è la prima fase della tecnica di assorbimento atomico e consiste in una serie di reazioni che portano alla dissociazione termica delle singole molecole o dei singoli ioni in atomi isolati. L’atomizzazione può avvenire nella fiamma, o nel fornetto di grafite.
Monocromatore

Compito del monocromatore è quello di separare la riga analitica da tutte quelle emesse dalla lampada.

Detector

Compito dei detector (fotomoltiplicatore) è di trasformare l’energia radiante in un segnale elettrico che viene trasferito ad un indicatore digitale o analogico.

Interferenze

Durante un’analisi mediante spettrofotometria di assorbimento atomico possono verificarsi numerose interferenze: chimiche, fisiche e spettrali.
Le interferenze chimiche: dovute a reazioni indesiderate (es. formazione di sali insolubili nella fiamma che non rendono possibile l’atomizzazione del metallo in esame, o incompleta atomizzazione dovuta a inadeguate condizioni della fiamma) e possono essere eliminate scegliendo la fiamma che meglio si adatta al problema del momento, in modo da ottenere la temperatura ideale e creare intorno all’analita l’ambiente più idoneo.
Le interferenze fisiche: derivano da differenze nella composizione del campione da analizzare rispetto agli standard utilizzati per la curva di lavoro; possono comportare un diverso comportamento all’interno del sistema di atomizzazione dovuto alle diverse caratteristiche fisiche del campione e degli standard.
Le interferenze spettrali: sono date da sovrapposizioni di segnali di assorbimento da parte del campione e delle eventuali sostanze interferenti (matrice complessa) alla lunghezza d’onda desiderata (es. interferenze date da altri metalli che presentano una linea spettrale situata in prossimità della riga di risonanza propria dell’elemento in analisi); anche fumi e sostanze organiche causano un assorbimento non riconducibile solo all’analita e quindi può comportare errori notevoli.

Relazione tra assorbimento atomico e concentrazione

Per determinare la quantità di un elemento si può atomizzare il campione in cui è contenuto, eccitare i suoi atomi con radiazioni di opportuna lunghezza d’onda e misurare l’entità della radiazione assorbita.
Alle normali temperature di esercizio (relativamente basse) la maggior parte degli atomi si trova nello stato fondamentale.
L’assorbimento, che dipende dal numero di atomi nello stato fondamentale, è direttamente proporzionale all’intera popolazione di atomi presenti sul cammino ottico della radiazione e quindi alla concentrazione dell’elemento nel campione.
In queste condizioni l’assorbimento atomico sia pure in un intervallo di linearità abbastanza ristretto segue una legge analoga alla legge di Beer. Per un generico elemento eccitato da una radiazione monocromatica i cui atomi siano dispersi in fase gassosa abbiamo che:

A = x · b · N

dove: x è il coefficiente spettrale di assorbimento atomico, b lo spessore dello strato assorbente (cammino ottico), N il numero totale di atomi liberi

Considerazioni generali

Gli spettri a righe vengono oggi impiegati non solo per condurre un’analisi qualitativa, essendo tali spettri caratteristici per ogni atomo (per la specifica distribuzione energetica degli orbitali), ma soprattutto per condurre un’analisi quantitativa.
In particolare, la spettroscopia di assorbimento atomico viene impiegata nell’analisi farmaceutica per effettuare la determinazione dei metalli residui nei farmaci provenienti da processi di fabbricazione.
Questa tecnica è altamente specifica (e questo è un indubbio vantaggio), ma ha dei limiti:
- è applicabile solo ad elementi metallici;
- ciascun elemento richiede una diversa sorgente di radiazione.

Tecnica NIRS (spettroscopia nel vicino infrarosso)

La tecnica NIRS (Near Infrared Reflectance Spectroscopy) è un metodo di analisi che sfrutta l’interazione della materia con le radiazioni del vicino infrarosso.
Principio: la tecnica si avvale della specifica capacità di ogni composto chimico di assorbire, trasmettere o riflettere la radiazione luminosa. La combinazione delle proprietà assorbenti con quelle di dispersione dell’energia luminosa, determina la diffusa riflettanza della luce, che contiene informazioni sulla composizione chimica del campione.

La scelta dei campioni

Per l’analisi di nuovi prodotti è necessario creare curve di taratura specifiche per le quali bisogna disporre di un adeguato e rappresentativo numero di campioni.
Idealmente, il set di calibrazione dovrebbe avere la più ampia variabilità possibile dei costituenti e la migliore uniformità dei campioni.

La calibrazione

L’approccio chemiometrico (estrazione d’informazioni chimiche usando un computer e la matematica) è utilizzato per mettere in relazione le proprietà fisico-chimiche dei campioni da analizzare con l’assorbimento di radiazioni, nell’intervallo di lunghezza d’onda del NIR.
Le informazioni cercate devono quindi essere parallelamente determinate con una tecnica indipendente. Primo passo: realizzazione di un esperimento di calibrazione, che comporta la creazione di un set di riferimento tramite la collezione di campioni che devono contenere tutte le possibili variazioni che si potrebbero trovare nei campioni sconosciuti.
Una volta ottenuto un adeguato e rappresentativo numero di curve di taratura, bisogna scegliere una metodologia statistica adeguata per ottenere la calibrazione (es. regressione lineare semplice o regressione lineare multipla).
Ottenuta la curva di calibrazione, si dovrà procedere alla sua validazione realizzandola all’inizio su un set di campioni noti, per procedere poi con nuovi campioni.

La calibrazione (segue)

Vantaggi:

il tempo impiegato per una singola analisi varia da pochi secondi a pochi minuti _ rapida indagine di numerosi campioni con una notevole diminuzione di tempo e costi rispetto alle tecniche tradizionali;
semplicità delle operazioni di preparazione e varietà di analisi realizzabili;
possibilità di riutilizzare il campione;
assenza di reagenti.

Svantaggi:

notevole complessità nella scelta del giusto algoritmo da utilizzare per l’interpretazione dei dati;
accurata procedura di calibrazione;
dipendenza dai metodi chimici tradizionali
il metodo non è applicabile ad una completa analisi di tutti i costituenti (es. elementi minerali).

Applicazioni della spettroscopia in alimentazione animale

UV – vis
- Carboidrati solubili in acqua (foraggi freschi ed insilati).
- Ammoniaca (foraggi freschi ed insilati).
- Acido lattico (foraggi freschi ed insilati).
- Tannini.

NIRS
- Composizione chimica (proteine, lipidi, fibra, ceneri).
- Digeribilità (dNDF, dSO).

AA
- Macro- e micro- elementi minerali (es. Co, Cr, Cd, Mn, Fe, Pb, Cu ) in alimenti vegetali e prodotti di o.a.

Cromatografia

La cromatografia é una tecnica di separazione di vari componenti di una miscela, al pari di una distillazione frazionata, di una cristallizzazione e una estrazione con solvente ma molto più efficace.
Fu ideata nel 1906 dal russo Tswett; la sua tecnica sperimentale, su una soluzione di clorofille, evidenziò la separazione dei vari pigmenti utilizzando una colonna impaccata con carbonato di calcio, ed eluendo con etere di petrolio, dando luogo alla formazione di strati di diverso colore (da cui il nome: ‘cromos’-colore).
La tecnica cromatografica consiste nello sfruttare in modo particolarmente efficiente la diversa attitudine che ogni molecola o ione possiede nel distribuirsi tra due differenti fasi (una stazionaria e una mobile).

Cromatografia (segue)

Una soluzione (fase mobile) costituita da un miscuglio di sostanze (A, B, C) disciolte in un solvente (S) passa attraverso un mezzo adsorbente opportunamente scelto (D, fase fissa o stazionaria). Ciascuna delle tre sostanze ha una diversa solubilità (A > B > C) e una diversa adsorbibilità nel materiale D (C > B > A). Quindi il solvente cede al materiale adsorbente più facilmente la sostanza C, meno la B e meno ancora A e la fase fissa della colonna è percorsa più rapidamente dal composto A, meno dal B e meno ancora dal C.
Applicando questo procedimento ai miscugli è possibile eseguire la separazione delle varie sostanze e quindi procedere alla loro identificazione (analisi qualitativa) raccogliendo poi le sostanze così separate è anche possibile procedere al loro dosaggio (analisi quantitativa).

Tecniche cromatografiche

Cromatografia di assorbimento solido-liquido (fase fissa solida, fase mobile liquida):
- la fase fissa è costituita da un solido attivo, cioè dotato di opportune proprietà adsorbenti verso le sostanze in esame, che sono disciolte in un solvente e attraversano l’adsorbente contenuto, per es., in una colonna di vetro (cromatografia di adsorbimento su colonna) o su strato sottile (cromatografia su strato sottile)

Cromatografia di ripartizione liquido-liquido (fase fissa liquida, fase mobile liquida):
- la fase fissa, costituita da un liquido attivo (solvente verso le sostanze in esame), distribuito in un supporto solido inerte, viene attraversato dalla fase mobile liquida (sostanza in esame disciolta in un solvente)

Cromatografia di adsorbimento gas-solido e cromatografia di ripartizione gas-liquido:
- la sostanza in esame viene trasformata in vapore → attraversa in fase gassosa il materiale di adsorbimento che può essere un solido adsorbente oppure un liquido in supporto poroso.

Tecniche cromatografiche (segue)

La cromatografia liquida può essere realizzata su colonna, su strato sottile e su carta, la gascromatografia si limita all’uso della colonna.
Tenuto conto dei diversi meccanismi di separazione e delle diverse soluzioni sperimentali adottabili, si sono sviluppate numerose tecniche cromatografiche, che comprendono:
- Cromatografia su strato sottile (TLC), dove la fase stazionaria può essere gel di silice, cellulosa in polvere, fatta aderire ad un apposito supporto (alluminio, carta plastificata, lastra di vetro) e la fase mobile é costituita da vari solventi organici.
- Cromatografia su carta (PC), dove la fase stazionaria é costituita dall’acqua inevitabilmente presente nella cellulosa come umidità (20%), anche se la carta può essere all’occorrenza trattata con liquidi diversi, e la fase mobile é scelta in funzione del tipo di fase stazionaria e delle proprietà chimiche dei composti da separare.
- Cromatografia su colonna a bassa pressione (LPC), la fase mobile é un liquido organico a bassa viscosità mentre le fasi stazionarie, solide, liquide o gel, possono avere caratteristiche chimico-fisiche molto variabili.
- Cromatografia in fase liquida ad elevate prestazioni (HPLC), che consiste nella versione strumentale della cromatografia su colonna. L’eluente viene fatto fluire ad alta pressione e le sostanze in uscita vengono rilevate strumentalmente con opportuni dispositivi.
- Gasromatografia (GC), in cui la fase mobile è un gas.

Classificazione dei principali metodi cromatografici

Gas cromatografia (GC)

Ha conosciuto un grande sviluppo a partire dagli anni ‘60, conserva tuttora una posizione di primo piano come tecnica analitica. L’unica limitazione della gas-cromatografia é la necessità di rendere volatili i campioni da analizzare, per cui in alcuni casi è sostituita dall’HPLC.
La fase mobile è un gas che fluisce attraverso una colonna, in cui si trova la fase stazionaria, la quale può essere un solido granulare poroso oppure un liquido supportato su materiale inerte o depositato sulle pareti di un capillare.
Con questa tecnica è possibile analizzare con successo campioni gassosi, liquidi o solidi vaporizzabili.

Strumentazione

Un gascromatografo è uno strumento relativamente semplice, dove un gas viene fatto fluire all’interno di una colonna, mantenuta in condizioni di flusso e temperatura estremamente controllate.
All’interno di questa corrente gassosa, tramite opportuni dispositivi (iniettori) viene introdotto il campione da analizzare che, attraversando la colonna cromatografica, viene separato in base ai principi di ripartizione e/o adsorbimento.
Il gas contenente le sostanze eluite viene inviato ad un rivelatore che, sfruttando differenti principi, fornisce un segnale elettrico direttamente proporzionale alla concentrazione.

Strumentazione (segue)

Il risultato di questa analisi consiste in un grafico (cromatogramma) dove in ascissa compare il tempo ed in ordinata il segnale fornito dl rivelatore.
In corrispondenza di una sostanza eluita compaiono così dei picchi il cui tempo di eluizione è caratteristico della sostanza stessa e la cui area o altezza, è direttamente proporzionale alla quantità di campione eluita.
Dall’elaborazione di questi dati, mediante opportune calibrazioni condotte analizzando sostanze di riferimento a concentrazione nota, è possibile effettuare una accurata analisi quantitativa di miscele anche molto complesse.

Esempio di gascromatogramma.

Strumentazione (segue)

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

La Cromatografia Liquida ad Alta Prestazione si basa sui medesimi principi fisici dell’adsorbimento, della ripartizione e dello scambio ionico, che caratterizzano le tecniche cromatografiche in generale.
L’impiego di fasi stazionarie ad elevata area superficiale, unitamente allo sviluppo di una adeguata tecnologia strumentale, consente a questa tecnica di raggiungere elevatissime efficienze, sia in termini di separazione, che di limiti di rilevabilità.

Strumentazione

Un cromatografo HPLC è costituito da una pompa per l’alimentazione della fase liquida, da un sistema di introduzione del campione, dalla colonna (cuore della separazione), da un sistema di rivelazione dei componenti eluiti ed infine da un sistema di raccolta ed elaborazione dati.
Questa tecnica consente di operare sofisticate separazioni di miscele complesse e di effettuare una accurata analisi quantitativa dei componenti costituenti la miscela stessa.

Strumentazione (segue)

Il risultato analitico di questa tecnica consiste in un diagramma che riporta in funzione del tempo la risposta del rivelatore.
In presenza di una sostanza eluita si ottiene così un picco il cui tempo di eluizione è caratteristico e la cui area e proporzionale alla quantità.

Cromatografia su colonna

Le fasi mobili in HPLC sono usualmente una miscela di uno o più solventi con le seguenti caratteristiche:
- proprietà fisiche: elevata purezza, basso costo, trasparenza UV, non corrosiva, bassa viscosità, bassa tossicità, non infiammabile, solventi il campione;
- forza: la forza è correlata alla polarità del solvente; l’acqua è un solvente forte in fase normale ma debole in fase inversa;
- selettività: dipende da interazioni tipo momento dipolare, dipolo indotto, legame ad H, ecc.

I solventi dovrebbero essere filtrati e degasati prima dell’uso.
Esempi di solventi in HPLC: n-esano, toulene, metanolo, propanolo, acetonitrile.

Caratteristiche

Fase stazionaria costituita da particelle molto piccole (3 – 10 μm).
Colonne di piccolo diametro 2 – 5 mm.
Pressioni di ingresso elevate.
Precisione nell’introduzione del campione.
Portata della fase mobile controllata.
Rivelatori in linea.

HPLC Vantaggi

Rapidità e precisione in analisi quantitative:
- Tipico tempo di analisi di 5 – 20 min.
- Precisione RSD < 0.5 – 1%.

Analisi automatizzate
- Usando autocampionatori ed elaboratori di dati.

Alta sensibilità
- Limite di rivelabilità di ng a pg.

Recupero del campione quantitativo
- Tecniche preparative da µg a g.

Adatta a diversi tipi di campioni
- Può analizzare > 60% di tutti i composti vs. 15% della GC.

Applicazioni della cromatografia in alimentazione animale

GC
- Acidi grassi volatili (foraggi freschi ed insilati).
- Alcooli (foraggi freschi ed insilati).
- Gas di fermentazione (CO2 e CH4).

HPLC
- Farmaceutico (analgesici, antibiotici).
- Ambientale (pesticidi, erbicidi, diossina).
- Biologico e bio-tecnologico (proteine, peptidi e amino acidi, separazione di DNA, RNA, polinucleotidi).
- Alimentare
  - Componenti di alimenti naturali (zuccheri, aminoacidi, trigliceridi, acidi grassi e acidi organici, vitamine).
  - Addittivi alimentari (conservanti, coloranti).
  - Contaminanti (micotossine, pesticidi e residui di farmaci).
- Plastificanti/Prodotti chimici.