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Maria Assunta Bevilacqua » 3.Gli enzimi: caratteristiche e cinetica enzimatica

Gli enzimi

Si comincia a parlare di enzimi nel 1850 con Pasteur, il quale osservò che:

La Fermentazione dello zucchero in alcol è catalizzata da “fermenti” li chiama enzimi e postula che siano inseparabili dalla struttura della cellula vivente.

Successivamente:

Nel 1897 Buckner estrae enzimi attivi da una cellula;
Nel 1926 Summer estrae, isola e purifica il primo enzima;
Studi successivi dimostrano la natura proteica degli enzimi;
Senza catalisi enzimatica non ci sarebbe vita, le reazioni chimiche sarebbero troppo lente;
La velocità è regolabile tramite il controllo dell’attività enzimatica.

Caratteristiche degli enzimi

Sono Proteine con attività catalitica, esistono migliaia di enzimi diversi, tutti necessari per il normale funzionamento di una cellula.
Il nome di un enzima deriva spesso da quello che l’enzima fà piuttosto che da quello che l’enzima è. Il Sistema di nomenclatura e di classificazione è basato sul tipo di reazione catalizzata (IUB, 1961) gli enzimi sono divisi in 6 classi principali:

Ossidoreduttasi (reazioni di ossido-riduzione);
Transferasi (trasferimento di gruppi funzionali);
Idrolasi (reazioni di idrolisi);
Liasi (addizione al doppio legame);
Isomerasi (reazioni di isomerizzazione);
Ligasi (formazione di legami con consumo di molecole di ATP).

Caratteristiche degli enzimi (segue)

Le principali caratteristiche degli enzimi sono:

La specificità di azione;
Il potere catalitico;
Alcuni enzimi per essere attivi hanno bisogno della presenza di cofattori:
- i cofattori possono essere ioni metallici o molecole organiche complesse;
- cofattori+ apoenzima = oloenzima (enzima biologicamente attivo).
Devono conservare la loro struttura immodificata;
Essere efficaci in piccole quantità;
Non devono influenzare l’equilibrio di una reazione chimica.

Come lavorano gli enzimi

La velocità di una reazione, misurata come quantità di prodotto ottenuto in un tempo definito, dipende dalla energia di attivazione.
Gli enzimi abbassano l’energia di attivazione, come si osserva in figura 1.

Gli enzimi modificano solo la velocità della reazione e non gli equilibri.
Quando un Substrato (S) interagisce con il suo specifico Enzima (E) per la formazione del complesso (ES) si tratta di interazioni deboli con rilascio di energia libera e abbassamento dell’energia di attivazione della reazione (Figura 2).

Fig. 1: l'enegia di attivazione si abbassa in una reazione catalizzata (curva b) rispetto ad una reazione non catalizzata (curva a)

Fig. 2: Formazione del complesso ES con liberazione dell'Enzima e del prodotto reazione P

Caratteristiche degli enzimi

Gli enzimi abbassano l'energia di attivazione di una reazione. Fonte: modificato da: 1998 Wadsworth Publishing Company/ITP

Specificità di catalisi: specificità di legame “Il sito attivo”

Il substrato si lega ad una regione specifica dell’enzima (sito attivo) in corrispondenza della quale avviene la reazione vera e propria, con formazione dei prodotti di reazione.

Caratteristiche del sito attivo:

occupa una parte relativamente piccola della molecola proteica (una regione di circa 20 amminoacidi);
Si trova in cavità o fenditure della molecola proteica;
È una entità tridimensionale;
I substrati si legano all’enzima mediante interazioni deboli (legami idrogeno, interazioni ioniche ed idrofobiche).

Cinetica enzimatica - 1

Specificità di catalisi: specificità di legame “Il sito attivo” (segue)

Modello chiave-serratura:
- il meccanismo di riconoscimento tra enzima e substrato è di tipo CHIAVE-SERRATURA;
Modello di adattamento indotto:
- In virtù dell’elasticità di cui è dotata la catena proteica, l’enzima si adatta alla forma del substrato, anche attraverso assestamenti successivi, come si osserva in figura.

Un esempio di modello chiave-serratura e di adattamento indotto

La teoria di Michaelis-Menten

Il primo modello cinetico per una semplice reazione enzima-singolo substrato, viene proposto da Henrj (1902) e da Michaelis e Menten (1913); la teoria di Michaelis-Menten prevede che il substrato si lega con l’enzima in corrispondenza del sito attivo per formare il complesso enzima-substrato ES, un composto intermedio molto poco stabile che molto rapidamente si scinde per dare il prodotto di reazione e rigenerare l’enzima. Si tratta di un modello basato su di una cinetica di saturazione poiché i siti attivi dell’enzima vengono progressivamente tutti occupati dalle molecole di substrato. Il complesso enzima-substrato è in equilibrio con l’enzima libero ed il substrato.
Questa situazione di equilibrio non è disturbata dalla formazione del prodotto poiché la costante k3 <<k2.

Leonor Michaelis e Maud Menten. Fonte: Scientia

Cinetica dello stato stazionario. Cinetica di saturazione

Come ottenere un’equazione cinetica che metta in relazione la velocità di catalisi con la concentrazione del substrato?

A) Velocità di catalisi proporzionale alla concentrazione di complesso ES: V_o =k₃[ES];

B) Allo stato stazionario le concentrazioni degli intermedi restano costanti:
k1[E][S]=(k2+k3)[ES] da cui ricavando [ES]: [ES]=[E] [S] k1/(k2+k3);

C) L’equazione ottenuta può essere semplificata introducendo una nuova costante:
KM = (k2+k3)/k1 costante di Michaelis-Menten;

D) sostituendo tale costante nell’equazione: [ES]= [E][S]/K_M ma [E]=[Etot]-[ES] da cui sostituendo e risolvendo l’equazione per ES, si ottiene l’espressione di ES da sostituire nella espressione iniziale: V=k3 [Etot] [S] / ([S] + KM).

Equazione cinetica

Equazione di Michaelis-Menten

La relazione tra [S] e la velocità della reazione enzimatica può essere espressa in modo quantitativo

$V_0=\frac{V_{max}[S]}{K_m+[S]}$

Possiamo definire il Km

$V_0=\frac 1 2 V_{max}\rightarrow K_m=[S]$

Km può essere considerata la misura dell’affinità di un enzima per il substrato: più è alta Km, minore è l’affinità e viceversa.

Definizione del Km

Possiamo definire il Km:

$V_0=\frac 1 2 V_{max}\rightarrow K_m=[S]$

Km può essere considerata la misura dell’affinità di un enzima per il substrato: più è alta Km, minore è l’affinità e viceversa.
Km rappresenta la quantità di substrato necessaria affinché la reazione avvenga con velocità pari a metà della velocità massima raggiungibile.

Equivale al rapporto:
Km = (K-1 + K2) / K1
Costante di dissociazione di ES se K2 è molto più piccolo di K-1

esprime l’affinità che l’enzima ha per il substrato;
Km bassa: questo è segno di alta affinità dell’enzima per il substrato;
Km alta: l’enzima presenta bassa affinità per il substrato.

Definizione del Km

Cinetica enzimatica

La velocità di una reazione catalizzata da un enzima dipende dalla concentrazione del substrato ed aumenta in maniera lineare finché tutti i siti attivi non sono stati occupati dal substrato (CINETICA DI SATURAZIONE) quando viene raggiunta la velocità massima diventa indipendente dalla concentrazione del substrato (iperbole rettangolare).

Come si misura la velocità di una reazione catalizzata?
Si può definire il numero di turnover un indice dell’attività catalitica. Rappresenta il numero netto di molecole di substrato convertite in prodotto da una singola molecola enzimatica nell’unità di tempo, quando l’enzima è totalmente saturato dal substrato.

La velocità di una reazione enzimatica in funzione della concentrazione del substrato descrive una iperbole rettangolare

Fattori che influenzano la velocità di una reazione enzimatica

La velocità di una reazione catalizzata è influenzata dalla concentrazione del substrato:
La velocità massima si raggiunge nel momento in cui l’enzima è saturato dal substrato, ovvero il numero delle molecole di enzima risulta uguale al numero delle molecole del complesso ES, come mostrato in figura.

La velocità di una reazione catalizzata è influenzata dalla temperatura, infatti un aumento della temperatura comporta:

denaturazione;
modificazione irreversibile del sito attivo;
drastica riduzione dell’attività catalitica.

In figura è riportato in grafico l’effetto dell’aumento della temperatura sulla velocità di una reazione catalizzata.
È possibile individuare una temperatura ottimale.

Effetto dell'aumento della concentrazione del substrato sulla velocità di una reazione catalizzata

Effetto dell'aumento della temperatura sulla velocità di una reazione catalizzata

Effetto del pH

La velocità di una reazione catalizzata è influenzata da variazioni del pH.

Il cambiamento del pH altera il grado di ionizzazione, sia la natura ionica del substrato che quella dell’enzima modificano il modo di combinarsi dell’uno con l’altro.
La curva della velocità di una reazione catalizzata in funzione della variazione del pH si presenta con un andamento a campana.
È possibile individuare un valore di pH ottimale al quale la velocità di reazione è massima esso è relativo alla natura e alla concentrazione del substrato.

Una serie di osservazioni:

l’andamento a campana della curva è conseguenza della differente distribuzione delle cariche sulle molecole del substrato e sull’enzima;
gli effetti delle variazioni del pH in prossimità del pH ottimale sono generalmente reversibili;
se ci si sposta, però, troppo verso la parte acida od alcalina l’attività massimale non può più essere ripristinata quando si riporta il pH al suo valore ottimale.

Effetto della variazione (aumento) del pH sulla velocità di una reazione catalizzata

Inibizione enzimatica

La velocità di una reazione catalizzata è influenzata dalla presenza di inibitori. L’inibitore è una molecola che impedisce all’enzima di funzionare correttamente.

L’inibizione può essere reversibile quando l’enzima può recuperare la sua attività biologica, in questo caso il tipo di inibitore può essere:

Inibitore competitivo;
Inibitore non competitivo;
Incompetitivo.

L’inibizione é irreversibile quando l’enzima perde la sua attività biologica. In questo caso la molecola di inibitore si lega con un legame covalente ad un residuo di un amminoacido presente nel sito attivo, modificando in modo irreversibile la forma del sito attivo e la conformazione della molecola enzimatica.
Un esempio:
I FOSFONATI: composti del fosforo utilizzati come gas nervini contendono all’acetilcolina il sito attivo per l’enzima acetilcolinesterasi. L’acetilcolina non viene scissa nei suoi prodotti inattivi (colina e acido acetico) e sollecita i muscoli a contrarsi ripetutamente provocando convulsioni e morte.

Equazione di Lineweaver – Burk

L’inverso della equazione di Michaelis-Menten. Si esprime nel grafico dei Doppi Reciproci:

$\frac{1}{V_0}=\frac{K_m}{V_{max}}\frac 1 {[S]}+\frac 1 {V_{max}}$

Una retta con pendenza Km/Vmax;
L’intercetta dell’asse x: -1/Km;
L’intercetta dell’asse y: 1/Vmax.

come descritto nella figura a lato.

Termini Vmax e Km nel grafico dei DOPPI RECIPROCI (equazione di Lineweaver - Burk)

Inibizione non competittiva

Nell’inibizione non competitiva:

L’inibitore si lega reversibilmente all’enzima in un sito diverso dal sito attivo (Figura 1);
Si deforma il sito attivo ma può ancora ricevere il substrato, si forma il complesso ESI (enzima-substrato-inibitore);
Numero di turnover si abbassa;
Diminuisce la Vmax ma il Km non varia (Figura 2).

L’inibitore incompetitivo si lega al complesso enzima – substrato già formato e ciò riduce significativamente le possibilità, per l’enzima, di disfarsi del prodotto: diminuzione di Km e Vmax (Figura 2).

Fig. 1: Linibitore non competitivo si lega in un sito diverso dal sito attivo

Fig. 2: nel grafico dei DOPPI RECIPROCI diminuisce la Vmax il Km non varia

Inibizione competitiva

Nell‘inibizione competitiva:

L’inibitore ha una forma simile a quella del substrato;
Si lega reversibilmente al sito attivo dell’enzima;
La competizione per conquistare il sito attivo dipende dalla concentrazione dei due contendenti (Figura 1);
La Km tende ad aumentare apparentemente quando sono presenti concentrazioni crescenti di [I];
La Vmax non cambia;
Il numero di turnover può scendere rapidamente a zero (Figura 2).

Fig. 1: Linibitore non competitivo si lega in un sito diverso dal sito attivo

Fig. 2: nel grafico dei DOPPI RECIPROCI diminuisce il Km la Vmax non varia

L’attività enzimatica è regolabile

L’attività di un enzima che segue una cinetica Mendeliana può essere regolata dalla variazione della concentrazione del Substrato.
A basse concentrazioni di substrato la reazione è di Primo ordine, cioè la velocità di reazione dipende dalla concentrazione del substrato; ad elevate concentrazione di substrato la reazione diventa di ordine zero, cioè indipendente dalla concentrazione del substrato (come in Figura).

Possiamo quindi affermare che: piccole variazioni nella concentrazione del substrato si riflettono in importanti variazioni sulla velocità del suo stesso metabolismo.

Cinetica degli enzimi Mendeliani

L’attività enzimatica è regolabile (segue)

L’attività di un enzima può inoltre essere regolata dalla presenza di un Enzima allosterico o Enzima Regolatore.

Un enzima allosterico:

non segue la cinetica di Michaelis–Menten;
modula la velocità con cui decorre l’intero processo metabolico, controllando e regolando i prodotti lungo una via metabolica;
deve essere costituito da due o più subunità proteiche (struttura quaternaria);
sull’enzima sono presenti più siti chimicamente attivi: il sito attivo o sito catalitico ed il sito dell’effettore o sito allosterico (allos = altro) detto anche sito regolatorio;
la sua attività è regolata dalla presenza del Modulatore o Effettore cioè da una molecola che si lega all’enzima in maniera non covalente, interagendo in siti lontani dal sito attivo dell’enzima.

I modulatori possono essere attivatori o inibitori (modulatore positivo o negativo).
Enzimi allosterici in cui il substrato è anche un Modulatore sono detti omotropi.
Enzimi allosterici in cui il modulatore è una molecola diversa sono detti eterotropi.

Enzimi allosterici

In seguito al legame con l’effettore o modulatore (positivo o negativo) l’enzima passa da una forma inattiva ad una forma attiva. Il legame con gli effettori interagisce in modo funzionale con il sito catalitico normale lo deforma spazialmente ne altera le proprietà e favorisce la stabilità di una o dell’altra configurazione.

La risposta degli enzimi in termini di variazione più o meno graduale della velocità di reazione in presenza di attivatori/inibitori rappresenta la chiave del controllo metabolico.

a) cambi conformazionali in un enzima allosterico; b) regolazione allosterica attraverso un regolatore attivatore/o inibitore

In seguito al legame con un effettore l'enzima passa da una forma inattiva ad una forma atttiva

Enzimi allosterici (segue)

Gli Enzimi allosterici sono costituiti da due o più subunità, presentano un Sito regolatorio (R)dove si lega il Modulatore ed un sito catalitico (C) dove si lega il Substrato (Vedi figura).

Gli effettori controllano l’attività di un enzima.
Effettore attivatore (positivo).
Effettore inibitore (negativo).
Gli Enzimi allosterici sono presenti in due forme: una forma attiva ed una inattiva tra loro in equilibrio.

Il legame con gli effettori interagisce in modo funzionale con il sito catalitico lo deforma spazialmente ne altera le proprietà e favorisce la stabilità di una o dell’altra configurazione.

C: subunità catalitica; R: subunità regolatoria. Il Substrato si lega al sito catalitico, il Modulatore alla subunità regolatoria

Effettore positivo e negativo

L’effettore positivo induce modificazioni che trasformano lo stato inattivo dell’enzima nella sua forma attiva: essa può legarsi al substrato.
L’effettore negativo induce una modificazione del sito attivo tale da impedire all’enzima di funzionare.

Quando La transizione tra uno stato di attività e l’altra è provocata dal substrato si parla di Effettore Omotropo.

Effetto positivo e negativo

Dettaglio effettore omotrope

La curva sigmoidale degli enzimi allosterici

Il legame della prima molecola di substrato influenza il legame delle molecole successive con EFFETTO COOPERATIVO. La cinetica di un enzima allosterico descrive una curva sigmoidale.
A basse concentrazioni di substrato si osserva una bassa affinità tra enzima e substrato, perché solo pochi siti attivi sono legati al substrato. Le prime molecole di substrato si legano lentamente poi sempre più rapidamente (sigmoide). Ad alti livelli di substrato il grafico diventa simile all’iperbolico.

Spesso un intermedio di una via metabolica (o il prodotto finale) funziona da INIBITORE ALLOSTERICO del primo enzima implicato nella via (fenomeno di retro inibizione).
Gli attivatori o inibitori allosterici modulano le vie metaboliche in modo da adattare la velocità delle reazioni alle esigenze funzionali della cellula.

Cinetica di un enzima regolato, la curva sigmoide degli enzimi regolati

Il fenomeno di retro-inibizione

La curva sigmoidale degli enzimi allosterici (segue)

Gli effettori modificano la Km ma non la Vmax. L’attivazione allosterica porta alla diminuzione della Km per il substrato. L’inibizione allosterica porta ad un aumento della Km per il substrato.