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Francesco Villani » 33.Cenni sui metodi e procedure di identificazione dei microrganismi


Principi sull’identificazione dei microrganismi

Isolamento in coltura pura

  • Qualsiasi microrganismo che cresce dando origine a colonie visibili su un substrato, sia selettivo che non, prima di essere identificato (speciazione) deve essere isolato in coltura pura. In natura i batteri raramente esistono come colture pure.
  • Coltura pura: popolazione di cellule derivante da una singola cellula.
  • Colture pure possono essere ottenute mediante la tecnica dello striscio su piastre: vicino alla fiamma di un becco Bunsen, aprire il coperchio della piastra quel tanto necessario a inserire l’ansa per prelevare la colonia da isolare in coltura pura. L’obiettivo dello striscio è di ottenere colonie isolate su una larga parte della superficie della piastra.
Piastra con popolazioni miste di microrganismi

Piastra con popolazioni miste di microrganismi

Piastra con una coltura pura di batteri

Piastra con una coltura pura di batteri


Fasi preliminari per l’identificazione dei batteri

Descrizione delle condizioni colturali

Si annotano:

  • Caratteristiche di crescita della colonia:
    • morfologia;
    • colore;
    • dimensioni, margini, altro;
    • eventuali variazioni del substrato (colore, aloni di chiarificazione, altro).
  • Condizioni di incubazione (atmosfera e temperatura).

Tutte queste caratteristiche possono risultare utili in prima istanza per una identificazione presuntiva del microrganismo.

Morfologia delle cellule batteriche (preparato microscopico a fresco)

  • Pulire e sgrassare un vetrino portaoggetti per microscopia.
  • Depositare una goccia di acqua sterile sul vetrino.
  • Prelevare con un’ansa da batteriologia sterile parte di una colonia ben isolata del microrganismo.
  • Stemperare il materiale microbico nell’acqua.
  • Coprire con un vetrino copri-oggetto, avendo cura di evitare la formazione di bolle d’aria.
  • Osservare al microscopio.

Possono presentare diverse forme:

  • cellule sferiche (cocchi): diplococchi (in coppia); streptococchi (aggregate in catene); stafilococchi (aggregate a forma di grappolo); micrococchi e sarcine (aggregate in tetradi);
  • cellule a forma di bastoncino singolo, in coppia o in catena: batteri, diplobatteri, streptobatteri;
  • cellule a forma di bastoncino corto, rigonfio e con margini arrotondati: coccobacilli;
  • cellule a forma di bastoncino: ricurvo (vibrioni); a spirale (spirilli).

Colorazione di Gram

  • Pulire e sgrassare un vetrino portaoggetti.
  • Porre una goccia di acqua sterile sul vetrino.
  • Stemperare il materiale microbico nell’ acqua.
  • Lasciare asciugare il preparato microbico all’aria.
  • Fissare il preparato tagliando tre volte la fiamma.
  • Colorare per 1 minuto con cristal violetto-ammonio ossalato.
  • Lavare con acqua.
  • Trattare per 1 minuto con Lugol.
  • Lavare con acqua.
  • Decolorare con alcool-acetone per 30 secondi.
  • Lavare con acqua.
  • Colorare con safranina per 1 minuto.
  • Lavare, asciugare e osservare al microscopio.

Lettura e interpretazione dei risultati: le cellule dei batteri Gram-positivi appaiono colorate in blu-violetto, mentre le cellule dei batteri Gram-negativi in rosso.

Presenza di endospore

  • Pulire e sgrassare un vetrino portaoggetti per microscopia.
  • Porre una goccia di acqua sterile sul vetrino.
  • Stemperare il materiale microbico nell’acqua.
  • Lasciare asciugare il preparato microbico all’aria.
  • Fissare il preparato alla fiamma.
  • Esporre il vetrino ai vapori di acqua bollente e coprire per 2 min con una soluzione acquosa satura di verde malachite.
  • Lavare con acqua per 10 sec.
  • Colorare con una soluzione acquosa di safranina allo 0,25% per 15 sec.
  • Lavare con acqua, asciugare ed osservare al microscopio.

Lettura e interpretazione dei risultati: le endospore appariranno colorate in verde all’interno delle cellule che saranno di colore rosa-rosso.

Fasi preliminari per l’identificazione dei batteri

Saggio della catalasi

  • Pulire e sgrassare un vetrino portaoggetti.
  • Depositare sul vetrino una goccia di H2O2 al 3%.
  • Stemperare il materiale microbico nella goccia di H2O2.

Positività del saggio: formazione di effervescenza dovuta alla liberazione di ossigeno che indica la presenza della catalasi nella coltura saggiata.


Saggio dell’ossidasi

  • Prelevare una colonia in esame cresciuta su substrato nutritivo agarizzato e stemperarla su carta da filtro (Whatman n°1).
  • Aggiungere alcune gocce di reattivo.

Positività del saggio: la coltura microbica assume, al massimo entro 10 minuti una colorazione violacea a contatto con il reattivo. La reazione è dovuta all’enzima citocromo a3 ossidasi (componente del sistema di trasporto degli elettroni) che riduce il Tetrametil-p-fenilendiammina idrocloride a un composto di colore viola.

Identificazione di un isolato batterico con metodi biochimici

Caratteristiche metaboliche (biochimiche) che possono riguardare:

  • determinazione delle sorgenti di energia, di carbonio e azoto;
  • determinazione dei prodotti derivanti dall’utilizzazione di composti azotati;
  • sensibilità a sostanze antimicrobiche;
  • capacità di fermentare i carboidrati.

Le attività biochimiche dei batteri possono essere determinate con:

  • Metodi tradizionali: prevedono l’inoculo della coltura da saggiare in substrati che contengono composti su cui agiscono gli enzimi implicati nello specifico processo metabolico.
  • Sistemi di identificazione multi-test: contengono in forma miniaturizzata i substrati necessari all’identificazione dell’isolato.

In genere, il risultato dell’attività enzimatica, è accompagnato da modificazioni cromatiche del substrato.

Prossima lezione

Fasi per la ricerca di specifici patogeni negli alimenti. Metodi immunologici di ricerca dei batteri patogeni.

Le lezioni del Corso

I materiali di supporto della lezione

Bell C., Neaves P., Williams A. P. (2005) Food Microbiology And Laboratory Practice. Blackwell Sciente, Uk.

Mossel D.A.A., Corry J.E.L., Struijk C.B., Baird R.M. (1995) Essentials Of The Microbiology Of Foods. A Text Book For Advanced Studies. John Wiley And Sons. Chichester, U.K

Roberts D., Hooper W., Greenwood M. (1995) Practical Food Microbiology. Phls, London.

Cenni sui metodi di identificazione dei microrganismi

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