Francesco Villani » 33.Cenni sui metodi e procedure di identificazione dei microrganismi

Fasi preliminari per l’identificazione dei batteri

Descrizione delle condizioni colturali

Si annotano:

• Caratteristiche di crescita della colonia:
  • morfologia;
  • colore;
  • dimensioni, margini, altro;
  • eventuali variazioni del substrato (colore, aloni di chiarificazione, altro).
• Condizioni di incubazione (atmosfera e temperatura).

Tutte queste caratteristiche possono risultare utili in prima istanza per una identificazione presuntiva del microrganismo.

Morfologia delle cellule batteriche (preparato microscopico a fresco)

• Pulire e sgrassare un vetrino portaoggetti per microscopia.
• Depositare una goccia di acqua sterile sul vetrino.
• Prelevare con un’ansa da batteriologia sterile parte di una colonia ben isolata del microrganismo.
• Stemperare il materiale microbico nell’acqua.
• Coprire con un vetrino copri-oggetto, avendo cura di evitare la formazione di bolle d’aria.
• Osservare al microscopio.

Possono presentare diverse forme:

• cellule sferiche (cocchi): diplococchi (in coppia); streptococchi (aggregate in catene); stafilococchi (aggregate a forma di grappolo); micrococchi e sarcine (aggregate in tetradi);
• cellule a forma di bastoncino singolo, in coppia o in catena: batteri, diplobatteri, streptobatteri;
• cellule a forma di bastoncino corto, rigonfio e con margini arrotondati: coccobacilli;
• cellule a forma di bastoncino: ricurvo (vibrioni); a spirale (spirilli).

Colorazione di Gram

• Pulire e sgrassare un vetrino portaoggetti.
• Porre una goccia di acqua sterile sul vetrino.
• Stemperare il materiale microbico nell’ acqua.
• Lasciare asciugare il preparato microbico all’aria.
• Fissare il preparato tagliando tre volte la fiamma.
• Colorare per 1 minuto con cristal violetto-ammonio ossalato.
• Lavare con acqua.
• Trattare per 1 minuto con Lugol.
• Lavare con acqua.
• Decolorare con alcool-acetone per 30 secondi.
• Lavare con acqua.
• Colorare con safranina per 1 minuto.
• Lavare, asciugare e osservare al microscopio.

Lettura e interpretazione dei risultati: le cellule dei batteri Gram-positivi appaiono colorate in blu-violetto, mentre le cellule dei batteri Gram-negativi in rosso.

Presenza di endospore

• Pulire e sgrassare un vetrino portaoggetti per microscopia.
• Porre una goccia di acqua sterile sul vetrino.
• Stemperare il materiale microbico nell’acqua.
• Lasciare asciugare il preparato microbico all’aria.
• Fissare il preparato alla fiamma.
• Esporre il vetrino ai vapori di acqua bollente e coprire per 2 min con una soluzione acquosa satura di verde malachite.
• Lavare con acqua per 10 sec.
• Colorare con una soluzione acquosa di safranina allo 0,25% per 15 sec.
• Lavare con acqua, asciugare ed osservare al microscopio.

Lettura e interpretazione dei risultati: le endospore appariranno colorate in verde all’interno delle cellule che saranno di colore rosa-rosso.

Fasi preliminari per l’identificazione dei batteri

Saggio della catalasi

• Pulire e sgrassare un vetrino portaoggetti.
• Depositare sul vetrino una goccia di H₂O₂ al 3%.
• Stemperare il materiale microbico nella goccia di H₂O₂.

Positività del saggio: formazione di effervescenza dovuta alla liberazione di ossigeno che indica la presenza della catalasi nella coltura saggiata.

Saggio dell’ossidasi

• Prelevare una colonia in esame cresciuta su substrato nutritivo agarizzato e stemperarla su carta da filtro (Whatman n°1).
• Aggiungere alcune gocce di reattivo.

Positività del saggio: la coltura microbica assume, al massimo entro 10 minuti una colorazione violacea a contatto con il reattivo. La reazione è dovuta all’enzima citocromo a₃ ossidasi (componente del sistema di trasporto degli elettroni) che riduce il Tetrametil-p-fenilendiammina idrocloride a un composto di colore viola.

Identificazione di un isolato batterico con metodi biochimici

Caratteristiche metaboliche (biochimiche) che possono riguardare:

• determinazione delle sorgenti di energia, di carbonio e azoto;
• determinazione dei prodotti derivanti dall’utilizzazione di composti azotati;
• sensibilità a sostanze antimicrobiche;
• capacità di fermentare i carboidrati.

Le attività biochimiche dei batteri possono essere determinate con:

• Metodi tradizionali: prevedono l’inoculo della coltura da saggiare in substrati che contengono composti su cui agiscono gli enzimi implicati nello specifico processo metabolico.
• Sistemi di identificazione multi-test: contengono in forma miniaturizzata i substrati necessari all’identificazione dell’isolato.

In genere, il risultato dell’attività enzimatica, è accompagnato da modificazioni cromatiche del substrato.

Prossima lezione

Fasi per la ricerca di specifici patogeni negli alimenti. Metodi immunologici di ricerca dei batteri patogeni.