Francesco Villani » 31.Numerazione di popolazioni microbiche specifiche degli alimenti

Materiali di laboratorio

Materiale comune occorrente per l’applicazione delle procedure

• Bilancia.
• Apparecchiatura e sacchetti sterili per omogeneizzazione.
• Attrezzi per la manipolazione del campione: coltelli, forbici, spatole, cucchiai, pinze, cilindri graduati, ecc., sterili.
• pipette da 10, 1 e 0,1 ml sterili.
• Tubi per batteriologia.
• Piastre Petri sterili.
• Incubatori.
• Vortex.
• Autoclave.
• Becco Bunsen.
• pHmetro.
• Diluente sterile.
• Terreni nutritivi.

Numerazione dei microrganismi aerobi mesofili e psicrotrofici

Materiale occorrente:

• Terreno nutritivo: PCA (Plate Count Agar; Lezione 27).

Operazioni:

• Preparare le diluizioni del campione (Lezioni 28 e 29).
• Seminare per inclusione (1 ml); aggiungere 15 ml di terreno nutritivo; lasciare solidificare.
• Incubare in aerobiosi a 30°C per 72 ore (microrganismi mesofili) o a 10°C per 7 giorni (microrganismi psicrotrofici).
• Lettura dei risultati.

Numerazione delle Enterobacteriaceae

Materiale occorrente:

• Terreno nutritivo: VRBGA (Violet Red Bile Glucose Agar, Lezione 27).

Operazioni:

• Preparare le diluizioni del campione (Lezioni 28 e 29).
• Seminare per inclusione (1 ml).
• Aggiungere 15 ml di terreno nutritivo; dopo solidificazione del terreno, versare un altro strato di terreno (circa 6-7 ml) al fine di assicurare condizioni anaerobiche favorevoli alla fermentazione del glucosio.
• Incubare a 37°C per 24 ore.
• Numerazione colonie tipiche: di colore rosa-rosso, circondate da un alone di colore porpora dovuto alla precipitazione dei sali biliari in ambiente acido.
• Conferma isolati: isolare 4-5 colonie su piastre di Agar nutritivo. Dopo incubazione a 35-37°C per 24 ore, sulle colonie isolate si determinerà la morfologia, la Gram-reazione, la catalasi e l’ossidasi (Lezione 33).

Numerazione dei Coliformi

Procedura

Inclusione in terreno nutritivo selettivo e differenziale agarizzato

Materiale occorrente:

• Terreno nutritivo: VRBGA (Violet Red Bile Glucose Agar, Lezione 27).

Operazioni:

• Preparare le diluizioni del campione (Lezioni 28 e 29).
• Seminare per inclusione (1 ml).
• Aggiungere 15 ml di terreno nutritivo; dopo solidificazione del terreno, versare un altro strato di terreno (circa 6-7 ml) al fine di assicurare condizioni anaerobiche favorevoli alla fermentazione del glucosio.
• Incubare le piastre a 30°C per 24 ore.
• Numerare le colonie tipiche: come conseguenza della fermentazione del lattosio, le colonie tipiche (diametro di circa 0,5 mm) appariranno colorate dal rosa al rosso intenso, circondate da un alone di colore rosso dovuto alla precipitazione dei sali biliari in ambiente acido.

Numerazione dei Coliformi

Procedura

Numero più Probabile (MPN) (Lezione 30): prova presuntiva.

Materiale occorrente:

• Terreno nutritivo: (Brilliant Green Bile Broth –BGBB, Lezione 27).

Operazioni:

• Schema di inoculo 1 – 0,1 – 0,01 ml (campione solido).
• Inoculare 3 tubi contenenti BGBB a concentrazione normale ciascuno con 1 ml della diluizione 1:10 (corrispondenti a inoculi di 0,1 g di campione per tubo).
• Inoculare 3 tubi contenenti BGBB a concentrazione normale ciascuno con 1 ml della diluizione 1:100 (inoculi di 0,01 g).
• Inoculare 3 tubi contenenti BGBB a concentrazione normale ciascuno con 1 ml della diluizione 1:1000 (inoculi di 0,001 g).
• Incubare a 30°C per 48 ore.
• Numerazione: sono considerati positivi i tubi che presentano sviluppo di gas nelle campanule di Durham. Ricavare dalle tavole il MPN/g.

Numerazione dei Coliformi: prova di conferma

Da ciascuna provetta positiva nella prova presuntiva:

• Strisciare un’ansata di coltura su una piastra di Agar Eosina Blue di Metilene (EMBA).
• Incubare le piastre a 32°C per 24 ore.
• Colonie tipiche di coliformi: di colore scuro con aspetto metallico verde iridescente se osservate con luce riflessa.

Conferma degli isolati. Almeno due colonie caratteristiche cresciute sulle piastre di EMBA vanno trapiantate:

• in una provetta munita di campanula di Durham e contenente come terreno nutritivo il Brodo Lattosato (per confermare, dopo incubazione a 30°C per 24 ore la produzione di gas da lattosio );
• su una piastra di Agar Nutritivo, per confermare, sulle colonie cresciute dopo 24 ore di incubazione a 30°C, la presenza di bastoncini gram negativi, catalasi positivi e ossidasi negativi.

Sulla base dei risultati ottenuti è possibile confermare o meno l’MPN presuntivo.

Numerazione di Escherichia coli

Procedura

Su terreno cromogenico.

Materiale occorrente:

• Terreno nutritivo: Triptone Bile X-Glucuronide (TBX). Contiene come cromogeno il 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucuronide che per azione dell’enzima β-glucuronidasi libera 5-bromo-4-cloro-3-indolo il quale è assorbito dalle cellule microbiche le cui colonie sul substrato assumono una colorazione blu/verde (Lezione 27).

Operazioni:

• Preparare le diluizioni del campione (Lezioni 28 e 29).
• Seminare per inclusione (1 ml).
• Aggiungere 15 ml di terreno nutritivo.
• Incubare le piastre per 4 ore a 30°C e per ulteriori 18 ore a 44°C.
• Numerare le colonie tipiche: blu/verde.

Numerazione degli Enterococchi

Procedura

Su terreno selettivo e differenziale.

Materiale occorrente

• Terreno nutritivo: Agar Kanamicina Esculina Azide (KAA).

Operazioni

• Preparare le diluizioni del campione (Lezioni 28 e 29).
• Seminare il terreno in superficie (0,1 ml).
• Incubare le piastre a 37°C per 24-48 ore.
• Numerare le colonie tipiche: circa 2-3 mm di diametro, di colore scuro e circondate da un alone marrone-nero dovuto alla riduzione dell’esculina ad esculetina.
• Conferma delle colonie presuntive: agglutinazione con antisieri gruppo-specifico; prove morfologiche (cocchi in coppia o catene Gram positivi), biochimiche (assenza dell’enzima catalasi) e fisiologiche (crescita in brodo a 45°C dopo 48 ore di incubazione, crescita in brodo contenente il 6,5% di NaCl dopo 72 ore di incubazione a 37°C).

Numerazione delle spore di clostridi solfito-riduttori

Procedura

Su terreno selettivo e differenziale.

Materiale occorrente

• Terreno nutritivo: l’Agar Triptosio Solfito Cicloserina (TSC).

Operazioni

• Preparare l’omogenato dell’alimento (diluizione 1:10).
• Trattare a 80°C per 10 minuti circa 10 ml della diluizione 1:10 per eliminare le forme vegetative, lasciando inalterate le spore.
• Raffreddare e allestire le diluizioni decimali seriali successive.
• Inoculare per inclusione (1ml).
• Aggiungere 12-15 ml di terreno nutritivo mantenuto fluido a 45-47°C. Dopo solidificazione versare sulla superficie del terreno solidificato altri 7-8 ml dello stesso terreno fluido.
• Incubare le piastre a 37°C per 24-48 in giare per anaerobiosi.
• Colonie caratteristiche: di colore nero, con un diametro di 3-7 mm. Spesso nel terreno sono presenti colonie incolori o colonie puntiformi di colore nero che non vanno considerate nel conteggio.

Prossima lezione

Numero di Microrganismi Aerobi Totali; Famiglia delle Enterobacteriaceae; Coliformi; Streptococchi fecali (enterococchi); Clostridi solfito riduttori.